基于多組學的耐鹽藥材羅布麻葉的品質(zhì)形成機制研究

基于多組學的耐鹽藥材羅布麻葉的品質(zhì)形成機制研究陳翠花

【摘要】：羅布麻葉為常用中藥材,系夾竹桃科植物羅布麻ApocynumvenetumL.的干燥葉,具平肝安神,清熱利水之傳統(tǒng)功效及降血壓、降血脂、抗抑郁、保肝、增強免疫、抗衰老、抗糖尿病血管病變等藥理作用,其藥用、茶飲歷史悠久,臨床上用于肝陽眩暈,心悸失眠,浮腫尿少,高血壓,神經(jīng)衰弱,腎炎浮腫等癥;茶飲具清涼去火,防止頭暈等保健功能。羅布麻為一廣布的耐鹽中藥資源,鹽脅迫環(huán)境與羅布麻葉藥材品質(zhì)密切相關,適度鹽脅迫可促進羅布麻葉有效成分的合成與積累,提高其藥材質(zhì)量。然而,在羅布麻葉品質(zhì)形成過程中,鹽脅迫如何影響羅布麻葉次生代謝產(chǎn)物的合成與積累及其響應鹽脅迫機制至今尚不清楚,因而,如何闡明鹽脅迫下羅布麻葉的品質(zhì)形成機制已成為羅布麻葉品質(zhì)提升工程中的關鍵問題。本課題在對羅布麻葉品質(zhì)評價研究的前提下,依據(jù)鹽脅迫誘導轉錄組、蛋白質(zhì)組的差異表達而影響次生代謝物合成積累的規(guī)律。借助多組學整合分析的優(yōu)勢和特點,采用轉錄組學和蛋白質(zhì)組學技術篩選和分析鹽脅迫下羅布麻葉的差異表達基因和差異表達蛋白質(zhì),用植物代謝組學技術篩選和鑒定鹽脅迫下羅布麻葉的特征性代謝差異標志物,并通過多組學關聯(lián)分析,探討鹽脅迫下羅布麻葉次生代謝物差異成因及其藥材品質(zhì)形成的內(nèi)在機制。從而為探索羅布麻葉藥材品質(zhì)形成過程提供基礎資料。主要研究內(nèi)容與創(chuàng)新性結果如下:1.文獻研究查閱羅布麻葉以及鹽脅迫下多組學分析的相關文獻,對其進行綜述。2.羅布麻葉中多元指標成分分析優(yōu)化建立了基于UFLC-QTRAP-MS/MS技術同時測定羅布麻葉中黃酮、有機酸、氨基酸及核苷類共43種活性成分含量的方法,對不同產(chǎn)地和種屬羅布麻葉和白麻葉共41批樣品進行比較分析,并結合主成分分析及灰色關聯(lián)度分析對樣品進行分類和質(zhì)量評價。結果表明,所建立的方法準確、可靠;羅布麻葉與大花羅布麻葉明顯區(qū)分,羅布麻葉質(zhì)量較好。從而為羅布麻葉藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和全面控制提供新的方法參考。3.羅布麻葉中黃酮類成分的組織定位和動態(tài)積累通過激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)確定了羅布麻葉中黃酮醇類化合物的組織定位,通過香草醛-HCl染色法觀察到黃烷醇的組織定位。LSCM觀察表明,黃酮醇類成分聚集在表皮細胞和木質(zhì)部導管壁中,特別是在原生質(zhì)體和細胞核中。黃烷醇類成分位于柵欄薄壁組織細胞和導管壁中,特別是在韌皮部的乳汁管中。根據(jù)槲皮素和山奈酚衍生物的最大發(fā)射波長之間的差異,通過2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯試劑處理使其具有熒光特性,山奈酚及其衍生物僅分布在角質(zhì)層中。采用HPLC法測定了不同采收期和不同生長部位的羅布麻葉中的5種黃酮類成分的含量。結果表明6、7月份不同部位的羅布麻葉中紫云英苷含量呈下降趨勢,而金絲桃苷和異槲皮苷含量較高。通過LSCM和香草醛-HCl染色確定了羅布麻葉中黃酮類化合物的組織定位,并且羅布麻葉中黃酮的含量與采收時間和生長部位有關。4.鹽脅迫下羅布麻葉質(zhì)量分析(1)鹽脅迫對羅布麻葉生理指標及多元指標成分的影響本實驗基于UFLC-QTRAP-MS/MS技術結合多元統(tǒng)計分析,基于生理指標和多元指標成分對各種濃度鹽脅迫響應變化系統(tǒng)地評價羅布麻葉的質(zhì)量。光合色素、滲透穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和抗氧化酶的生理特性研究四種濃度(分別為0、100、200和300mMNaCl)的鹽脅迫下羅布麻葉的耐鹽機制。此外,從鹽脅迫處理下的羅布麻葉中定量了43種指標成分,包括14種氨基酸、9種核苷、6種有機酸和14種黃酮成分。另外,采用多元統(tǒng)計分析,包括層次聚類分析、主成分分析和灰色關聯(lián)度分析,分別對樣本進行系統(tǒng)聚類、區(qū)分和評價。結果表明,與對照組相比,低、中濃度鹽脅迫處理組有助于維持光合作用、滲透平衡、抗氧化酶活性以及代謝產(chǎn)物的積累,并且這兩個處理組比其他組的質(zhì)量好。然而,在重度脅迫下,由于不能有效清除活性氧導致氧化損傷積累和代謝產(chǎn)物減少,從而羅布麻葉質(zhì)量下降。綜上所述,該方法有助于羅布麻葉和其他耐鹽中藥材的質(zhì)量評價。(2)基于譜-效關系的鹽脅迫下羅布麻葉質(zhì)量分析建立了化學指紋圖譜與保肝活性之間的關系,以評價鹽脅迫處理后羅布麻葉的質(zhì)量。通過UFLC-TripleTOF-MS/MS技術得到不同鹽濃度處理后的羅布麻葉樣品的特征指紋圖譜,并基于共有特征峰,使用層次聚類分析進行相似性分析。通過生化標志物和組織病理學研究了羅布麻葉對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷的保肝作用,結果表明與其他濃度鹽脅迫處理組相比,高劑量的低濃度鹽濃度脅迫下的羅布麻葉會明顯改善小鼠肝損傷?；诙嘧兞拷y(tǒng)計分析,包括灰色相關分析和雙變量相關性分析,運用化學指紋圖譜和保肝活性之間的譜-效關系。結果表明,在低濃度鹽脅迫下的羅布麻葉中,多酚類化合物(如黃酮和酚酸)的積累可以有效清除自由基。因此,本實驗結合化學指紋圖譜和生物活性,可更全面的評價鹽脅迫下羅布麻葉的質(zhì)量。5.鹽脅迫下羅布麻葉的多組學分析(1)基于RNA-seq技術的鹽脅迫下羅布麻葉轉錄組學分析采用基于Denovo組裝的RNA-seq技術對四組不同濃度鹽脅迫處理下羅布麻葉進行轉錄組學分析。使用BLAST將所有基因比對到NT、NR、Swiss-prot、COG、KEGG、GO、Interpro數(shù)據(jù)庫進行功能注釋,根據(jù)差異倍數(shù)和錯誤發(fā)現(xiàn)率篩選出差異表達基因,依據(jù)差異基因代謝通路對羅布麻葉耐鹽機制進行分析。結果顯示,與空白組相比,低、中、高濃度鹽脅迫下的羅布麻葉分別有807、1512、1258個差異表達基因。這些差異表達基因參與苯丙素類、黃酮類、萜類生物合成、氨基酸合成等164個KEGG通路。結果發(fā)現(xiàn),鹽脅迫顯著上調(diào)了淀粉和蔗糖代謝、糖酵解、萜類合成、植物激素信號轉導、植物與病原體相互作用、谷胱甘肽代謝、核糖體等基因的表達。本實驗的轉錄組學分析對揭示鹽脅迫下鹽生植物羅布麻的耐鹽機制和了解其質(zhì)量形成機制具有一定的意義。(2)基于iTRAQ技術的鹽脅迫下羅布麻葉的蛋白質(zhì)組學分析基于iTRAQ的蛋白質(zhì)組學分析了四組鹽處理水平的羅布麻葉樣品中蛋白質(zhì)的變化。與對照組相比,鹽處理的羅布麻葉中分別發(fā)現(xiàn)了143、162和167個DEPs。它們主要參與碳水化合物和能量代謝、代謝物的生物合成和信號轉導。結果表明碳和氮的代謝在鹽脅迫下發(fā)生了變化。中、低水平的鹽脅迫增強了光合功能,并加速了碳水化合物的代謝。然而,重度鹽脅迫抑制了次生代謝物的生物合成。(3)基于UFLC-TripleTOF-MS/MS的鹽脅迫下羅布麻葉的代謝組學分析為了解鹽生植物的耐鹽機理,本實驗采用了基于超快速液相色譜串聯(lián)三重飛行時間質(zhì)譜的代謝組學分析技術。結果表明,各組之間的代謝譜圖可以區(qū)分。差異代謝物屬于多種化學類別。此外,在所有鹽脅迫的羅布麻葉組中,苯丙素類途徑和萜類化合物的生物合成均受到干擾。從各種指標成分的相對含量和光合色素的生理變化、滲透穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和抗氧化酶方面來看,低濃度鹽處理組優(yōu)于其他組的樣品。本研究基于植物代謝物變化的整體水平,可為羅布麻葉的耐鹽機制和品質(zhì)評價提供一些參考。(4)鹽脅迫下羅布麻葉組學關聯(lián)分析通過指標成分含量、譜-效關系、代謝組學相關聯(lián),篩選出7個質(zhì)量差異標志物—原花青素B2、灰青斑鳩菊內(nèi)酯B、黃蟬花定、槲皮素、山奈酚、異槲皮苷、乙?；愰纹ぼ铡Ｍㄟ^轉