生物化學(xué)教案【蛋白質(zhì)】-課件

蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)-英文為“Protein”——第一重要.

功能蛋白,大多為球狀；細(xì)胞膜—載體蛋白（物質(zhì)、信號(hào)）、酶細(xì)胞質(zhì)(包括細(xì)胞器)—酶（物質(zhì)代謝）、信號(hào)傳遞細(xì)胞核—酶（遺傳）、結(jié)構(gòu)蛋白（染色體骨架）細(xì)胞質(zhì)(包括細(xì)胞器)—酶（物質(zhì)代謝）、信號(hào)傳遞蛋白質(zhì)分布廣泛、功能多樣1.催化功能-酶2.結(jié)構(gòu)功能-皮、毛、骨、牙、

細(xì)胞骨架3.載運(yùn)功能-膜蛋白4.調(diào)控功能-激素5.運(yùn)動(dòng)功能-鞭毛、肌肉蛋白6.防御功能-免疫球蛋白7.神經(jīng)傳導(dǎo)基本功能輔助功能第四章

蛋白質(zhì)化學(xué)第一節(jié)

蛋白質(zhì)的分子組成第二節(jié)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)第三節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第四節(jié)氨基酸、蛋白質(zhì)的分離與鑒定蛋白質(zhì)化學(xué)1(分類）

蛋白質(zhì)功能

形狀球蛋白：球形、易溶解。組成溶解性

纖維蛋白：形似纖維、不溶于水。單純蛋白：只有α－氨基酸，多數(shù)蛋白。清蛋白（白蛋白）：溶于水。球蛋白：微溶于水，溶于稀鹽。醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇。綴合蛋白：與非蛋白質(zhì)物質(zhì)結(jié)合，如核、糖、脂蛋白。活性蛋白：如酶、激素，受體、膜蛋白。非活性蛋白：膠原蛋白、角蛋白、彈性蛋白。一、蛋白質(zhì)的元素組成二、組成蛋白質(zhì)分子的基本單位—氨基酸三、肽鍵與肽第一節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成多數(shù)蛋白質(zhì)含:

碳(C)50～56%氫(H)6～8%

氧(O)19～24%氮(N)13～19%

硫(S)0～4%有些蛋白質(zhì)含有磷少數(shù)含鐵、銅、錳、鋅、鈷、鉬等個(gè)別還含有碘一、蛋白質(zhì)的元素組成1凱氏(Kjedahl)定氮法一、蛋白質(zhì)的元素組成2蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，蛋白質(zhì)含量。含氮量*6.25=蛋白含量

每克樣品含氮的克數(shù)×6.25×100

=100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(克%)（三）蛋白質(zhì)的水解（一）氨基酸的分類（二）不常見的氨基酸（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)二、氨基酸（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)

氨基酸是含有氨基的酸CHRCOO－H3N+(甘油醛的D型、L型)D-甘油醛L-甘油醛透視式投影式氨基酸的構(gòu)型L－氨基酸D－氨基酸（二）氨基酸的分類1（三種分類法）1．根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)分為：

（1）脂肪族氨基酸（2）芳香族氨基酸（3）雜環(huán)氨基酸2．根據(jù)酸堿性質(zhì)

（1）酸性氨基酸（2）堿性氨基酸（3）中性氨基酸3．根據(jù)R基團(tuán)的極性

（1）非極性R基氨基酸（2）極性R基氨基酸（不帶電荷的、帶正電荷的、帶負(fù)電荷的）（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸1一氨基一羧基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)甘氨酸氨基乙酸GlycineGly(G)甘（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸2一氨基一羧基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)丙氨酸-氨基丙酸AlanineAla(A)丙（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸3一氨基一羧基氨基酸3普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)纈氨酸-氨基異戊酸ValineVal(V)纈（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸4一氨基一羧基氨基酸4普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)亮氨酸-氨基異己酸LeucineLeu(L)亮（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸5一氨基一羧基氨基酸5普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)異亮氨酸-氨基--甲基戊酸IleucineIle(I)異亮（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸6一氨基二羧基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)天冬氨酸-氨基丁二酸AspartateAsp(D)天（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸7一氨基二羧基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)谷氨酸-氨基戊二酸GlutamateGlu(E)谷（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸7含酰胺基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)天冬酰胺AsparagineAsn(N)（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸9含酰胺基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)谷氨酰胺GlutamineGln(Q)（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸10二氨基一羧基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)精氨酸-氨基--胍基戊酸ArginineArg(R)精（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸11二氨基一羧基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)鳥氨酸-二氨基戊酸OrnithineOrn鳥（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸12二氨基一羧基氨基酸3普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)賴氨酸，-二氨基己酸LysineLys(K)賴（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸13羥基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)絲氨酸-氨基--羥基丙酸SerineSer(S)絲

（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸14羥基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)蘇氨酸-氨基--羥基丁酸ThreonineThr(T)蘇（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸15含巰基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)半胱氨酸-氨基--巰基丙酸CysteineCys(C)半胱（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸16含巰基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)胱氨酸二(-氨基--巰基丙酸)CysteineCys-Cys胱（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸17含硫基氨基酸3普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)甲硫氨酸(蛋氨酸)-氨基--甲硫基丁酸MethionineMet(M)甲硫（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)2）芳香族氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)苯丙氨酸-氨基--苯基丙酸PhenylalaninePhe(F)苯丙（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)2）芳香族氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)酪氨酸-氨基--對羥苯基丙酸TyrosineTyr(Y)酪（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)3）雜環(huán)氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)組氨酸-氨基--咪唑基丙酸HistidineHis(H)組（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)3）雜環(huán)氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)色氨酸-氨基--吲哚基丙酸TryptophanTrp(W)色（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)3）雜環(huán)氨基酸3普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)脯氨酸四氫吡咯-2-羧酸ProlinePro(P)脯亞氨基酸（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)3）雜環(huán)氨基酸4普通名稱化學(xué)名英文名代號(hào)代號(hào)羥脯氨酸4-羥基吡咯烷-2-羧酸HydroxprolineHyp羥（二）氨基酸的分類2（據(jù)酸堿性質(zhì)）酸性氨基酸天冬氨酸谷氨酸（二）氨基酸的分類2（據(jù)酸堿性質(zhì)）堿性氨基酸賴氨酸精氨酸組氨酸（二）氨基酸的分類2（據(jù)酸堿性質(zhì)）中性氨基酸

含一氨基一羧基的氨基酸，包括兩種酸性氨基酸產(chǎn)生的酰胺（谷氨酰胺和天冬酰胺）。（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基因極性）非極性氨基酸1苯丙氨酸胱氨酸蛋氨酸甘氨酸丙氨酸纈氨酸亮氨酸異亮氨酸脯氨酸色氨酸（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團(tuán)極性）非極性氨基酸2

甘氨酸按理屬于極性的，但因其α-碳上的氫受到易解離的α-氨基和α-羧基的影響，因此不體現(xiàn)極性。（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團(tuán)極性）極性氨基酸1不帶電荷的酪氨酸半胱氨酸絲氨酸蘇氨酸天冬酰胺谷氨酰胺（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團(tuán)極性）極性氨基酸2帶正電荷的(堿性氨基酸)賴氨酸精氨酸組氨酸（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團(tuán)極性）極性氨基酸3帶負(fù)電荷的(酸性氨基酸)天冬氨酸谷氨酸（三）不常見的氨基酸-丙氨酸-氨基丁酸H2N-CH2-CH2-COOHH2N-CH2-CH2-CH2-COOH1．酸水解2．堿水解3．酶水解（三）蛋白質(zhì)的水解（三）蛋白質(zhì)的水解1（酸水解）

常用方法：硫酸或鹽酸處理濃度:鹽酸為6mol/L

硫酸為4mol/L

條件:回流煮沸20小時(shí)左右優(yōu)點(diǎn):不引起消旋作用，得到L-氨基酸缺點(diǎn):色氨酸完全被沸酸所破壞羥基氨基酸（絲,蘇）部分被水解天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下來。（三）蛋白質(zhì)的水解1（堿水解）常用方法：用氫氧化鈉處理濃度:5mol/L條件:共煮10~20h優(yōu)點(diǎn):色氨酸穩(wěn)定缺點(diǎn):多數(shù)氨基酸遭到不同程度的破壞，并且產(chǎn)生消旋現(xiàn)象；所得為D型和

L型混合氨基酸；堿水解引起精氨酸脫氨，生成鳥氨酸和尿素。（三）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解1）優(yōu)點(diǎn):不產(chǎn)生消旋作用，也不破壞氨基酸。缺點(diǎn):需要幾種酶協(xié)同作用，酶水解所需時(shí)間較長。

（三）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解2）（牛胰蛋白酶）胰蛋白酶1（三）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解2）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點(diǎn)R1：賴氨酸（Lys）精氨酸（Arg）特點(diǎn)：專一性較強(qiáng)，水解速度快胰蛋白酶2（三）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解3）糜蛋白酶1（三）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解3）糜蛋白酶2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點(diǎn)R1：苯丙氨酸(Phe)色氨酸（Trp）蘇氨酸(Thr)亮氨酸(Leu)特點(diǎn)：水解稍慢（三）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解4）胃蛋白酶1（三）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解4）胃蛋白酶2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點(diǎn)R1、R2：苯丙氨酸(Phe)色氨酸（Trp）蘇氨酸(Thr)亮氨酸(Leu)特點(diǎn)：水解速度較快（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)1物理性質(zhì)物理性狀：無色結(jié)晶物。熔點(diǎn)：熔點(diǎn)高，一般在200℃以上。溶解性：通常能溶于極性溶劑,而不溶于非極性溶劑;各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中。旋光性：風(fēng)味：（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)1

氨基酸在溶液中主要以兼性離子形式存在CHRCOO－H3N+（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)2加酸時(shí)CHRCOOHH3N+H+H+總電荷“+”（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)3加堿時(shí)CHRCOO-H2N總電荷“－”O(jiān)H－OH－（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)5等電點(diǎn)（pI）：當(dāng)溶液為某一pH值，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數(shù)目正好相等時(shí)(凈電荷為0),這一pH值即為氨基酸的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸既不向正極也不向負(fù)極移動(dòng)，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)4COO－CHH3N+R+OH－+H+COO－CHH2NR+OH－+H+在酸性溶液中（pH＜pI）在晶體狀態(tài)或水溶液中（pH=pI）在堿性溶液中（pH＞pI）（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)7丙氨酸pI的計(jì)算COO－CH+H+H3N+CH3K1COOHCHH3N+CH3COO－CHH2NCH3K2Ala+Ala±Ala－K1=[Ala±][H+]/[Ala+][Ala+]=[Ala±][H+]/K1K2=[Ala－][H+]/[Ala±][Ala－]=[Ala±]K2/[H+]到達(dá)等電點(diǎn)時(shí)，[Ala+]=[Ala－]∴[Ala±][H+]/K1=[Ala±]K2/[H+]，即：K1K2=[H+]2兩邊取負(fù)對數(shù)：－lg[H+]2=－lgK1－lgK2∵－lg[H+]

=pH－lgK1=pK1－

lgK1=pK2∴2pH=pK1＋pK2令pI為等電點(diǎn)時(shí)的pH，則：pI＝（pK1＋pK2）/2（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)8天冬氨酸pI的計(jì)算Asp+Asp±Asp－COOHCHH3N+CH2COOHCOO－CHH3N+CH2COOHCOO－CHH3NCH2COK1KRK2Asp=COO－CHH2NCH2COO－等電點(diǎn)時(shí)為Asp±∴pI＝（pK1＋pKR）/2O－+（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)9賴氨酸pI的計(jì)算Lys++Lys+Lys±COOHCHH3N+(CH2)4NH3+COO－CHH3N+(CH2)4NH3+COO－CHH2N(CH2)4NH3+K1K2KRLys－COO－CHH2NCH2NH2等電點(diǎn)時(shí)為Lys±∴pI＝（pK2＋pKR）/2（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)6側(cè)鏈不含解離基團(tuán)的中性氨基酸，其等電點(diǎn)是它的pK’1和pK’2的算術(shù)平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2同樣，對于側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK’值的算術(shù)平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R)/2堿性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R)/2

（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)3芳香族氨基酸的紫外吸收光譜1構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm苯丙氨酸的max＝257nm色氨酸的max＝280nm（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)3芳香族氨基酸的紫外吸收光譜2（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)α-氨基參加的反應(yīng)：亞硝酸反應(yīng)、2，4-二硝基氟苯反應(yīng)等。α-羧基參加的反應(yīng)：疊氮、脫羧、成鹽、成酯反應(yīng)。α-氨基和α-羧基共同參加的反應(yīng)：茚三酮反應(yīng)及成肽反應(yīng)。側(cè)鏈參與的反應(yīng)：（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)1α│氨基參加的反應(yīng)1與亞硝酸反應(yīng)原理：自由氨基能與亞硝酸反應(yīng)釋放出氮?dú)?，每克分子的自由氨基可生成一克分子氮?dú)狻Ｔ谏a(chǎn)上常用此法來測定蛋白質(zhì)的水解程度。RCHCOOHNH2+HNO2RCHCOOHOH+N2↑+H2O（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)2

AADNFB+多肽蛋白+HF

DNP-AADNP-多肽

DNP-蛋白原理：在弱堿性溶液中，氨基酸的α-氨基很容易與DNFB作用，生成穩(wěn)定的黃色DNP-氨基酸（2，4一二硝基苯氨基酸）,多肽或蛋白質(zhì)N-末端氨基酸的α-氨基也能與DNFB反應(yīng)用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨基酸,亦稱Sanger反應(yīng)。2，4一二硝基氟苯反應(yīng)1（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)22，4一二硝基氟苯反應(yīng)2RCHNH2+HF+NO2FNO2COOHRCHNCOOHHpH8~9NO2NO2DNP-氨基酸（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)22，4一二硝基氟苯反應(yīng)35—二甲氨基萘磺酰氯（丹磺酰氯）可以來代替DNFB。因?yàn)樗哂袕?qiáng)烈的熒光，可用熒光光度計(jì)快速檢出，靈敏度高。O=S=OClCH3NCH3（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)2丹磺酰氯反應(yīng)（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)3異硫氰酸苯脂反應(yīng)1用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨基酸,亦稱Edman反應(yīng)。弱堿AAPITC+多肽蛋白AAPTC—多肽蛋白HFPTH-AA+少一個(gè)AA的多肽或蛋白異硫氰酸苯酯苯氨基硫甲酰--苯硫乙酰脲（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)3異硫氰酸苯脂反應(yīng)2NH2CHCOR2NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNCOCHNHSCR1PTH-氨基酸PTC-氨基酸HFpH8.3（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)3α│氨基參加的反應(yīng)1甲醛反應(yīng)RCHNH3+HCHORCHNHCH2OHHCHORCHN(CH2OH)2羥甲基氨基酸二羥甲基氨基酸用途：進(jìn)行氨基酸的酸堿滴定COO－COO－COO－（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)3α│羧基參加的反應(yīng)疊氮反應(yīng)YNHCHCOOHRNH2NH2+2H2OYNHCHCONHNHRHNO2YNHCHCON3R用途：可活化羧基，常用于人工合成肽過程。酰化氨基酸?；被岬碾卵苌秕；被岑B氮（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)4α-氨基與α-羧基共同參加的反應(yīng)1茚三酮水合茚三酮茚三酮反應(yīng)1（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)4α-氨基與α-羧基共同參加的反應(yīng)1用途：常用于氨基酸的定性或定量分析茚三酮反應(yīng)2還原茚三酮茚三酮藍(lán)紫色物質(zhì)（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)4α-氨基與α-羧基共同參加的反應(yīng)1茚三酮反應(yīng)3脯氨酸及羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)物N+黃色化合物（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)4α-氨基與α-羧基共同參加的反應(yīng)2成肽反應(yīng)用途：是多肽和蛋白質(zhì)生物合成的基本反應(yīng)構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸有

種，一般可根據(jù)氨基酸側(cè)鏈（R）的

大小分為

側(cè)鏈氨基酸和

側(cè)鏈氨基酸兩大類。其中前一類氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的共同特怔是具有

性；而后一類氨基酸側(cè)鏈（或基團(tuán)）共有的特征是具有

性。堿性氨基酸（pH6～7時(shí)荷正電）有兩種，它們分別是

氨基酸和

氨基酸；酸性氨基酸也有兩種，分別是

氨基酸和

氨基酸。紫外吸收法（280nm）定量測定蛋白質(zhì)時(shí)其主要依據(jù)是因?yàn)榇蠖鄶?shù)可溶性蛋白質(zhì)分子中含有

氨基酸、

氨基酸或

氨基酸。氨基酸與水合印三酮反應(yīng)的基團(tuán)是

，除脯氨酸以外反應(yīng)產(chǎn)物的顏色是

；因?yàn)楦彼崾恰獊啺被?，它與水合印三酮的反應(yīng)則顯示

色。精氨酸的Pk1=2.17、Pk2=9.04（-NH3）Pk3=12.48（胍基）PI=（

）A、1/2(2.17+9.04)B、1/2(2.17+12.48)C、1/2(9.04+12.48)D、1/3（2.17+9.04+12.48）谷氨酸的Pk1=2.19(-COOH)、pk2=9.67(-NH3)、pk3=4.25(-COOH)pI=（

）A、1/2（2.19+9.67）

B、1/2（9.67+4.25）C、1/2(2.19+4.25)D、1/3(2.17+9.04+9.67)pH為8時(shí)，荷正電的氨基酸為（

）A、GluB、LysC、SerD、Asn氨基酸與亞硝酸反應(yīng)所釋放的N2氣中，氨基酸的貢獻(xiàn)是（

）A、25%B、50%C、80%D、100%三、肽鍵與肽1CH3CHNH2COOH+CH2OHCHNH2COOHH2OCH3CHNH2COCH2OHCHNHCOOH(酰胺鍵)－N端－C端CNOH肽鍵三、肽鍵與肽2肽鍵

肽鍵就是由氨基酸的α-羧基與相鄰的氨基酸的α-氨基脫水縮合起來的鍵。三、肽鍵與肽3肽肽:氨基酸通過肽鍵連結(jié)起來的化合物。二肽:兩個(gè)氨基酸形成的肽。三肽:三個(gè)氨基酸形成的肽。多肽:許多氨基酸形成的肽。蛋白質(zhì):多是組成氨基酸超過50個(gè)的多肽。氨基酸殘基:氨基酸由于形成肽鍵而失去了一分子水，因此表現(xiàn)出其分子的不完整。末端氨基和末端羧基：縮合后的氨基酸，只在肽的兩端有自由的α-氨基和α-羧基，簡稱N-端和C-端。三、肽鍵與肽4肽鏈的命名肽鏈的命名：根據(jù)組成的氨基酸殘基來確定。規(guī)定從肽鏈的N-端殘基開始，依次稱為某氨基酰、氨基酰……某氨基酸。如：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸NH2SerGlyTryAlaLeuCOOHNH2

SerGlyTryAlaLeuCOOH肽鍵：

肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。酰胺平面

多肽鏈的立體結(jié)構(gòu)三、肽鍵與肽5二硫鍵1二硫鍵：是由二個(gè)半胱氨酸殘基的側(cè)鏈之間形成的。即胱氨酸的殘基中的二硫鍵。二硫鍵類型：可以使兩條單獨(dú)的肽鏈共價(jià)交聯(lián)起來（鏈間二硫鍵）；也可以使一條鏈的某一部分形成環(huán)（鏈內(nèi)二硫鍵）。三、肽鍵與肽5二硫鍵2半胱氨酸H2半胱氨酸三、肽鍵與肽5二硫鍵3鏈間二硫鍵NHCHCONHCHCONHCHCOR1R2CH2SSCH2NHCHCONHCHCONHCHCOR3R4二硫鍵HSCH2CHCOO－NH3+半胱氨酸三、肽鍵與肽5二硫鍵2鏈內(nèi)二硫鍵第二節(jié)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)

二、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象一、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)1☆蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，又稱為化學(xué)結(jié)構(gòu)，是指氨基酸在肽鏈中的排列順序及二硫鍵的位置，是多肽鏈具有共價(jià)鍵的主鏈結(jié)構(gòu)。最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)是由數(shù)條多肽鏈組成。一級結(jié)構(gòu)(Primarystructure)的含義一、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)2一、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)3牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)1一、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)3

我國1965年在世界上第一個(gè)用化學(xué)方法人工合成的蛋白質(zhì)就是這種牛胰島素。胰牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)2二、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象1(目錄）(一)蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)(二)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)

(三)蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象2(定義）

蛋白質(zhì)分子的三維構(gòu)象也稱空間結(jié)構(gòu)或高級結(jié)構(gòu)。指的是蛋白質(zhì)分子中原子基團(tuán)在三維空間上的排列、分布及肽鏈的走向。

二、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象3(示例1蛋白酶抑制劑）二、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象3(示例3木瓜及組織蛋白酶）二、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象3(示例5）（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)1定義：主鏈上原子的局部空間排列而形成的折疊、盤曲構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈構(gòu)象。類型：天然蛋白質(zhì)一般均含有α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的結(jié)構(gòu)。

（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵3（5）二硫鍵（二硫橋）：兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。此鍵作用很強(qiáng)，可把不同肽鏈或同一條肽鏈的不同部分連在一起，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象起重要作用。大多數(shù)蛋白質(zhì)分子由于二硫鍵的斷裂其生物學(xué)活性隨即喪失。維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵主要是次級鍵（氫鍵、離子鍵、疏水作用和范德華力）。這些次級鍵是非共價(jià)鍵。肽鍵、二硫鍵、酯鍵等被稱之為共價(jià)鍵。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋最常見的二級結(jié)構(gòu)形式。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋特點(diǎn)1①每隔3.6個(gè)氨基酸殘基，螺旋上升一圈。上升一圈相當(dāng)于向上平移0.54nm，即每個(gè)氨基酸殘基上升0.15nm，每個(gè)殘基沿軸旋轉(zhuǎn)1000。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋特點(diǎn)2②氨基酸殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)，相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵。氫鍵是由每個(gè)氨基酸殘基的N-H與前面隔三個(gè)氨基酸殘基的C=0形成的。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋特點(diǎn)3③一般為右手螺旋。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋特點(diǎn)4④鏈中如有脯氨酸，則螺旋被中斷，產(chǎn)生一個(gè)“結(jié)節(jié)”，這是因?yàn)楦彼岬膩啺被系臍鋮⑴c肽鍵形成后沒有多余的氫原子形成氫鍵，這樣肽鏈拐彎不再形成α-螺旋。脯氨酸（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋特點(diǎn)5⑤另外，甘氨酸由于沒有側(cè)鏈的約束，難以形成α-螺旋所需的二面角。其次，如肽鏈中連續(xù)存在帶相同電荷的氨基酸，由于同性電荷相斥也會(huì)影響α-螺旋不穩(wěn)定。甘氨酸（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)

當(dāng)將α-螺旋用熱水和稀堿等方法處理或用力拉直，此時(shí)α-螺旋被伸展，氫鍵被破壞，而形成β-折疊。

（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)2在-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為0.35nm。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)3

-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)4

平行式反平行式所有肽鏈的N-端都在同一邊相鄰兩條肽鏈的方向相反（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)

側(cè)面觀（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型3（3）β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)1這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。-轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸殘基組成彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的-C=O

和第四個(gè)殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型3（3）β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)2

β-轉(zhuǎn)角（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型3

α螺旋β折疊片β轉(zhuǎn)角自由回轉(zhuǎn)超二級結(jié)構(gòu)

在蛋白質(zhì)中，特別是球狀蛋白質(zhì)中，經(jīng)?？梢钥吹接扇舾上噜彽亩壗Y(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，形成規(guī)則的，在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體充當(dāng)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)件，稱為超二級結(jié)構(gòu)。已知的超二級結(jié)構(gòu)有三種基本組合形式：（αα），（βαβ）和（βββ）。

結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位。多肽鏈在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成緊密的近似球行的結(jié)構(gòu)，具有部分生物功能。

在較大的蛋白質(zhì)分子中，由于多肽鏈上相鄰的超二級結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系，形成二個(gè)或多個(gè)在空間上可以明顯區(qū)別它與蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)的區(qū)別。一般每個(gè)結(jié)構(gòu)域約由100-200個(gè)氨基酸殘基組成，各有獨(dú)特的空間構(gòu)象，并承擔(dān)不同的生物學(xué)功能。（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)1

定義：蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(TertiaryStructure)是具有二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域的多肽鏈，由于其序列上相隔較遠(yuǎn)的氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用，而進(jìn)行范圍廣泛的盤曲和折疊，形成包括主、側(cè)鏈在內(nèi)的空間排列，這種在一條多肽鏈中所有原子的三維空間的整體排布成為三級結(jié)構(gòu)。維系力：主要有氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力和二硫鍵等。尤其是疏水鍵，在蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中起著重要作用。維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵1（1）氫鍵：一個(gè)氫原子連接兩個(gè)電負(fù)性強(qiáng)的原子（如氧、氮等）。其中一個(gè)為共價(jià)鍵，另一個(gè)即為氫鍵。在α-螺旋和β-折疊中占有極重要的地位，對蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的維護(hù)也很重要。（2）靜電引力：正負(fù)帶電基團(tuán)之間的吸引力，如NH3+與COO-。靜電引力較強(qiáng)，但對蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的穩(wěn)定貢獻(xiàn)不是很大，有時(shí)也稱為離子鍵或鹽鍵。維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵2（3）范德華力：是分子間的吸引力，是原子團(tuán)相互接近時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的。它變化多樣，對維持蛋白質(zhì)活性中心的構(gòu)象影響很大。（4）疏水相互作用：是非極性基團(tuán)為了避開水相而群集在一起的作用力。疏水作用是維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的重要因素。（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)3維持三級結(jié)構(gòu)的作用力1（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)3維持三級結(jié)構(gòu)的作用力2無三級結(jié)構(gòu)形成三級結(jié)構(gòu)（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)3維持三級結(jié)構(gòu)的作用力3

肽鍵

二硫鍵離子鍵

氫鍵疏水鍵

范德華力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol這四種鍵能遠(yuǎn)小于共價(jià)鍵，稱次級鍵。次級鍵微弱但卻是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中主要的作用力,原因是因?yàn)槠鋽?shù)量巨大。（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)4

（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)5

肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)（四）蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)1

很多蛋白質(zhì)分子是由兩個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)立的、具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的。這些多肽鏈之間并沒有共價(jià)鍵的聯(lián)系，只是借次級鍵締合在一起，這就形成了四級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)分子中，各個(gè)亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用。在四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子中，每個(gè)具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈單位稱為亞基，亞基多無生物學(xué)活性，具有完整四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子才有生物活性。（四）蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)2

（四）蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)3

血紅蛋白中四亞基兩兩相同，分別稱為α1、α2、β1、β2血紅細(xì)胞（四）蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)4血紅蛋白中的二聚體之一α2與β2第三節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的分子量二、兩性解離和等電點(diǎn)三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)五、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)一、蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的分子量一般在1萬—100萬道爾頓（相對分子質(zhì)量）由于是生物大分子，因此在溶液中極不穩(wěn)定，不能用測定小分子物質(zhì)的方法（如冰點(diǎn)降低、沸點(diǎn)升高）來測定一般以滲透壓法、凝膠過濾、聚丙烯酰胺凝膠電泳及超離心法來測定其分子量。超離心法較準(zhǔn)確，但實(shí)驗(yàn)條件要求很高二、兩性解離和等電點(diǎn)1+OH－+H++OH－+H+COOHPrH3N+COO－PrH3N+COO－PrH2NpH＜pI4＜7pH=pI7=7pH＞pI9＞7

由于蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，氨基酸所具有的兩性解離性質(zhì)，蛋白質(zhì)也同樣具有二、兩性解離和等電點(diǎn)2肽與氨基酸都有α－COOH，α－NH2，但肽還含有側(cè)鏈R基上的可解離基團(tuán)，且其為主要解離基團(tuán)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：在某一pH值時(shí)，蛋白質(zhì)所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即靜電荷為零，這時(shí)溶液的pH為該蛋白的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)由其所含的氨基酸的種類和數(shù)量決定。蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，溶解度最小。原因是等電點(diǎn)時(shí)，靜電荷為零，溶液中沒有相同電荷的互相排斥作用，蛋白質(zhì)分子由于靜電引力迅速結(jié)合成較大的聚集體而沉淀出來。蛋白質(zhì)兩性解離的特點(diǎn)二、兩性解離和等電點(diǎn)3在同一pH溶液中，由于各種蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量以及分子大小不同，因此它們在電場中的移動(dòng)速度也有差別，可以利用這種性質(zhì)來分離和分析蛋白質(zhì)，稱為蛋白質(zhì)電泳分析法。常用的有紙上電泳、醋酸纖維膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)兩性解離的應(yīng)用1二、兩性解離和等電點(diǎn)3蛋白質(zhì)兩性游離的應(yīng)用2電泳三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)1

由于蛋白質(zhì)分子大，且球狀蛋白質(zhì)分子中親水的氨基酸殘基多位于顆粒表面，故在水溶液中能與水起水合作用。因此，蛋白質(zhì)的水溶液具有親水膠體的性質(zhì)為什么蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)2蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有二個(gè)穩(wěn)定因素，即顆粒表面的水化層和電荷。若無外力條件作用，不致互相凝集。蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的原因三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)3蛋白質(zhì)具有許多高分子溶液的性質(zhì)。如擴(kuò)散、粘度大、不能透過半透膜。利用不能透過半透膜的性質(zhì)可以將蛋白質(zhì)和其他一些小分子分開，常用方法有透析和超濾。三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)4透析血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機(jī)透析液血液加壓三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)4超濾四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)1(概述)蛋白質(zhì)的沉淀:當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)分子的水化膜被破壞或電荷被中和后，使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象。原理:蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素有水化層和帶電層,水化層是蛋白質(zhì)分子表面的許多親水基團(tuán)與水分子結(jié)合形成的一層水膜，它使蛋白質(zhì)顆粒不能相互接觸聚集成大顆粒；帶電層是蛋白質(zhì)分子表面的可解離基團(tuán)在一定pH環(huán)境下解離產(chǎn)生的。由于帶同性電荷的蛋白質(zhì)顆粒相互排斥，也使蛋白質(zhì)顆粒不能聚集，當(dāng)改變這些穩(wěn)定因素，蛋白質(zhì)分子相聚集而從溶液中析出。

。四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式1)定義:加入大量中性鹽(硫酸銨)以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)而使蛋白質(zhì)從水溶液沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(溶解度最小，易沉淀)則效果最好。各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。因此，調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)的溶液中的中性鹽的濃度，可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。1．鹽析1（高濃度鹽類）四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式1)1．鹽析2為什么加入硫酸銨會(huì)引起蛋白質(zhì)的鹽析？當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式2)pH稍大于等電點(diǎn)為宜，因?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)帶負(fù)電，易與金屬離子結(jié)合成鹽。通常這種沉淀為變性的，如控制溫度（低溫）并控制重金屬離子濃度，則可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。

2．重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式3)某些生物堿試劑（如苦味酸、鎢酸、鞣酸、碘化鉀等）及某些酸（三氯乙酸、水楊磺酸、硝酸等）與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀。沉淀?xiàng)l件應(yīng)當(dāng)是pH小于等電點(diǎn)，這樣蛋白質(zhì)帶正電，易與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。3．生物堿試劑與某些酸類沉淀蛋白質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式4)可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等能破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)而使蛋白質(zhì)沉淀。如酒精的消毒作用。在低溫條件下，變性進(jìn)行較緩慢，可以用來制備蛋白質(zhì)。其優(yōu)點(diǎn)在于：不像鹽析那樣存在有大量鹽類，必須經(jīng)透析除去，而且有機(jī)溶劑很易通過稀釋透析及蒸發(fā)等方法除去。4．有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式5)將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉下。雞蛋煮熟后，本來流動(dòng)的蛋清、蛋黃都變成固體樣的東西了。這是蛋白質(zhì)凝固作用應(yīng)用于食品加工的典型例子。5．加熱凝固五、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性（變性1）定義:以某些物理或化學(xué)因素的作用，使蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間構(gòu)象被破壞（不包括肽鍵的斷裂），而引起蛋白質(zhì)若干理化和生物學(xué)性質(zhì)的改變。影響蛋白質(zhì)變性的因素:紫外線照射、加熱煮沸、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽和有機(jī)溶劑處理等。原理:維持蛋白質(zhì)二級、三級和四級結(jié)構(gòu)的嚴(yán)格構(gòu)象的力只是一些弱的次級鍵，它們很容易被破壞。特點(diǎn):天然構(gòu)象被破壞，蛋白質(zhì)失去了生物學(xué)活性。五、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性（變性2）五、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性（變性3）五、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性（復(fù)性）復(fù)性:某些變性蛋白質(zhì)，再除去變性因素后，可以重新獲得其天然結(jié)構(gòu)和生物活性，稱為蛋白質(zhì)的“復(fù)性”。如有一些球蛋白被熱或極端pH變性后，若緩慢冷卻或緩慢恢復(fù)到正常pH時(shí)，將重新獲得其天然結(jié)構(gòu)和生物活性。這種復(fù)性現(xiàn)象，即蛋白質(zhì)折疊研究中的所謂“折疊”。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)11.雙縮脲反應(yīng)1原理:蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)，形成紅紫色混合物。應(yīng)用:可以用此反應(yīng)來定性測定蛋白質(zhì)；也可在540nm處比色，定量測定蛋白質(zhì)。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)12H2N－C－NH2H2N－C－N－C－NH2＋NH3↑1800COOHO尿素雙縮脲雙縮脲CuSO4+NaOH紫紅色物質(zhì)1.雙縮脲反應(yīng)2六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)22.酚試劑（福林-酚試劑）反應(yīng)原理:蛋白質(zhì)分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）應(yīng)用:常用此反應(yīng)來定量測定蛋白質(zhì)含量。（考馬思亮蘭G-250法）六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)3含有芳香族氨基酸，特別是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白質(zhì)所特有的呈色反應(yīng)。蛋白質(zhì)溶液遇硝酸后先產(chǎn)生白色沉淀，加鹽則白色沉淀變成黃色，再加堿呈橙黃色。因?yàn)橄跛釋⒌鞍踪|(zhì)分子中的苯環(huán)硝化，產(chǎn)生了黃色硝基苯衍生物3．蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng)1六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)33．蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng)2

硝基酚（黃色）

鄰硝醌酸鈉（橙黃色）六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)44．米倫反應(yīng)米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合液。當(dāng)?shù)鞍兹芤褐屑尤朊讉愒噭┖蠹串a(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。由于酚類化合物有此反應(yīng)，酪氨酸含有酚基，故有此反應(yīng)。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)5．乙醛酸反應(yīng)1在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間就會(huì)出現(xiàn)紫色環(huán)。凡含有吲哚基的化合物都有此反應(yīng)，由于色氨酸含有類似結(jié)構(gòu)，因此含有色氨酸或含色氨酸的蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)5．乙醛酸反應(yīng)2六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)66．坂口反應(yīng)1原理:精氨酸分子中的胍基，能與次氯酸鈉、或次溴酸鈉及α－萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色產(chǎn)物。應(yīng)用:此反應(yīng)可以用來鑒定含有精氨酸的蛋白質(zhì)，也可用來測定精氨酸的含量。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)66．坂口反應(yīng)2紅色六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)66．坂口反應(yīng)3第四節(jié)氨基酸及蛋白質(zhì)分離提純1無論是對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究，或是生產(chǎn)人們所需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，都涉及蛋白質(zhì)的分離純化。目前對蛋白質(zhì)的制備，主要是從生物組織中提取分離。一般的程序?yàn)椋?/p>

前處理：組織、細(xì)胞破碎等。

粗分級：鹽析、沉淀等。

細(xì)分級：層析、電泳等。第四節(jié)氨基酸及蛋白質(zhì)分離提純2一、氨基酸的分析分離

二、蛋白質(zhì)混合物的分離方法

三、蛋白質(zhì)的鑒定

一、氨基酸的分析分離1類型：分配層析法(包括柱層析、紙層析和薄層層析)基本原理：所有的層析系統(tǒng)通常都由兩個(gè)相組成，一個(gè)為固定相的或靜相；一個(gè)為流動(dòng)相或動(dòng)相。一、氨基酸的分析分離2分配系數(shù)Kd

：混合物在層析系統(tǒng)中的分離，決定于該混合物的組分在兩相中的分配情況，即分配系數(shù)：

Kd=CA/CBCA，CB分別代表某一物質(zhì)在互不相溶的兩相A，B中的濃度。一、氨基酸的分析分離2有效分配系數(shù)Keff：某一物質(zhì)在層析系統(tǒng)中的行為并不直接決定于它們的分配系數(shù)Kd,而是取決于有效分配系數(shù)Keff。Keff＝某物質(zhì)在A相中的總量/某物質(zhì)在B相中的總量對于液相-液相層析系統(tǒng)來說,Keff＝(CA×VA)/(CB×VB)＝Kd×RV這里的VA,VB分別為A相和B相的體積，RV為A，B兩相的體積比。由此可見，Keff是RV的函數(shù)，溶質(zhì)的有效分配系數(shù)可以調(diào)整兩相的體積比而加以改變。一、氨基酸的分析分離3

利用層析法分離混合物（例如氨基酸混合物），其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異，哪怕是很小的差異，一般差異越大，越容易分開。

一、氨基酸的分析分離41．分配柱層析2．濾紙層析3．薄層分析4．離子交換層析5．氣相色譜6．高效液相色譜（HPLC）1．分配柱層析1柱層析中的填充物或稱支持劑，都是一些具有親水性的不溶物質(zhì)，如纖維素、淀粉、硅膠等。以它們作為固定相（靜相）。用各種緩沖液（流動(dòng)相）來溶出。在柱上端加上氨基酸混合物樣品，那么此樣品就會(huì)在兩相之間發(fā)生連續(xù)分配,混合物中具有不同分配系數(shù)的各種成分沿柱以不同的速度向下移動(dòng)。分步收集柱下端的洗出液，用茚三酮顯色定量。以氨基酸對洗出液體積作圖，得洗脫曲線，曲線中的每個(gè)峰相當(dāng)于某一種氨基酸。1．分配柱層析2洗脫劑樣品填充物玻璃柱分步收集設(shè)想的板層S=固定相M=流動(dòng)相1．分配柱層析3ABCDE321616816841241228812212345階段1．分配柱層析4分溶曲線與轉(zhuǎn)移次數(shù)（理論板數(shù)）n的依賴關(guān)系00.250.50.751.0相對濃度n=6n=100n=10002．濾紙層析1濾紙上，水被吸附在纖維素的纖維之間，形成固定相，展層用的溶劑是流動(dòng)相。層析時(shí)，混合氨基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置，然后用茚三酮顯色。此層析可以進(jìn)行二向?qū)游?。第一向?qū)游鐾瓿珊?，烘干濾紙?jiān)儆昧硪蝗軇游觯ㄅc第一向?qū)游鱿啻怪保?。這種方法不僅可用于氨基酸分析，還可用于糖的分析和核苷酸的分析，是一個(gè)非常有用的方法。2．濾紙層析2AA1AA2AA3AA4abc標(biāo)準(zhǔn)樣品原點(diǎn)原點(diǎn)（2）酚－甲酸－水（1）丁醇－醋酸氨基酸單向紙層析圖譜氨基酸雙向紙層析圖譜DADS2．濾紙層析3氨基酸在紙上移動(dòng)的速度稱比移值或遷移率，以符號(hào)Rf代表。也就是原點(diǎn)到溶劑前沿的距離（Ds）同原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)（即原色點(diǎn)）中心的距離(DA)的比值Rf＝DA/DS同一氨基酸對一定溶劑系統(tǒng)的Rf值是常數(shù)，因而可用來鑒別氨基酸。3．薄層分析這是近十幾年發(fā)展起來的一種微量而快速的層析法。不僅適于氨基酸的分離鑒定，而且可用于許多其他的天然物質(zhì)的定性、定量測定以及小量樣品的分離提純。大體步驟：把支持劑（硅膠粉、纖維素粉）涂布于玻璃板上，使之成一個(gè)薄層；把要分析的樣品，滴加在薄層的一端，然后用合適的溶劑進(jìn)行展層，使樣品中各個(gè)成分分離；最后進(jìn)行鑒定和定量測定。

4．離子交換層析1

就是用離子交換樹脂作支持劑的一種層析法。離子交換樹脂是具有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性高分子化合物。4．離子交換層析2

陽離子交換樹脂含有的酸性基團(tuán)如－S03H(強(qiáng)酸型)或－COOH（弱酸型）可解離出H+，當(dāng)溶液中含有其他陽離子時(shí)，例如在酸性環(huán)境中的氨基酸陽離子，它們可以和H+發(fā)生交換而“結(jié)合”在樹脂；相反，陰離子交換樹脂，可解離出OH－，能和溶液里的陰離子（如堿性環(huán)境中的帶負(fù)電的氨基酸）發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。為了使氨基酸從樹脂柱上洗脫下來，需要降低氨基酸與樹脂間的親和力（靜電吸引及氨基酸側(cè)鏈與樹脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水相互作用）。有效的方法是逐步提高洗脫劑的pH和鹽濃度（離子強(qiáng)度），這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來。4．離子交換層析3RCHCOOHNH3++M1A+RCHCOOHNH3M1+A+

氨基酸（在酸性溶液中）陽離子交換劑

氨基酸鹽RCHCOO－NH2+M2B－RCHCOOM2NH2+B－

氨基酸（在堿性溶液中）陰離子交換劑

氨基酸鹽M1為酸性基團(tuán)，M2為堿性基團(tuán)5．氣相色譜定義：層析系統(tǒng)的流動(dòng)相為氣體，固定相為涂漬在固體顆粒表面的液體，因此也叫氣－液色譜。優(yōu)點(diǎn)：氣相色譜法具有微量快速的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)：但在分析生物成分方面存在一個(gè)限制，它要求樣品能氣化，且對熱的穩(wěn)定性高。而氨基酸由于含有各種極性基團(tuán)，氣化十分困難，必須把它轉(zhuǎn)變成容易揮發(fā)的化合物才能進(jìn)行氣相層析。6．高效液相色譜（HPLC）這是近十幾年內(nèi)發(fā)展起來的一項(xiàng)快速、靈敏、高效的分析分離技術(shù)。其特點(diǎn)是使用的固定相支持劑顆粒很細(xì)，因而表面積很大。溶劑系統(tǒng)采取高壓，因此洗脫速度增大。許多層析如離子交換層析、吸附層析及凝膠過濾層析等多種類型的柱層析都可用HPLC來代替。

二、蛋白質(zhì)混合物的分離方法1．根據(jù)分子大小不同的分離方法2．根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法3．根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性的分離方法4．根據(jù)配體特異性的分離方法—親和層析法

1．根據(jù)分子大小不同的分離方法（1）透析和超濾（2）密度梯度（區(qū)帶）離心（3）凝膠過濾（分子篩層析）（1）透析和超濾1

利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖、水等分開。常用的半透膜是玻璃紙、火棉紙和其他合成材料。（1）透析和超濾2小分子溶出小分子被帶出透析（1）透析和超濾3

超濾（2）密度梯度（區(qū)帶）離心1蛋白質(zhì)顆粒和沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度，常用的密度梯度為蔗糖梯度。蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成各自獨(dú)立的區(qū)帶。（2）密度梯度（區(qū)帶）離心2蔗糖濃度％4％8％12％16％20％塑料離心管滴加樣品（3）凝膠過濾（分子篩層析）1

這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。凝膠珠是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，凝膠的交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。Q定了凝膠的分級范圍，即能被該凝膠分離開來的蛋白質(zhì)混合物的分子量范圍。（3）凝膠過濾（分子篩層析）2主要原理：當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而被排阻在凝膠珠外，隨著溶液在凝膠珠之間的孔隙向下移動(dòng)，并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度地自由出入凝膠珠的內(nèi)外，這樣由于不同大小的分子所經(jīng)的路徑不同而得到分離。大分子物質(zhì)先被洗脫出來，小分子物質(zhì)后被洗脫出來。常用的凝膠:葡聚糖凝膠（sephadex）、瓊脂糖凝膠(sepharose)聚丙烯酰胺凝膠（Biogel）（3）凝膠過濾（分子篩層析）3蛋白質(zhì)混合樣2．據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法（1）蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析（2）等電點(diǎn)沉淀法（3）低溫有機(jī)溶劑沉淀法

蛋白質(zhì)溶解度的主要影響因素：1，溶液的pH；2，離子強(qiáng)度；3，介電常數(shù)；4，溫度（1）蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析1(鹽溶1)鹽溶：中性鹽對球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著的影響。低濃度時(shí)，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。機(jī)理：主要是蛋白質(zhì)吸附某種鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而且蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用加強(qiáng)，因而溶解度提高。在透析過程中，球蛋白分子沉淀析出，是因?yàn)槌チ他}離子，使蛋白質(zhì)之間相互吸引，引起蛋白質(zhì)聚集。（1）蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析1(鹽溶2)等電點(diǎn)時(shí)，疏水基團(tuán)相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種疏水作用力，使分子分散，溶于水中（1）蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析2(鹽析1)鹽析：一般鹽濃度增大時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度趨于減低，當(dāng)鹽濃度足夠大時(shí)，蛋白質(zhì)可從溶液中完全沉淀出來，稱為鹽析。以硫酸銨（中性鹽）最常應(yīng)用。因其溶解度大，且不易傷害蛋白質(zhì)。另外常用的鹽還有硫酸鈉、硫酸鎂及氯化鈉等。（1）蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析2(鹽析2)

蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時(shí)，它們被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結(jié)合、沉淀。（2）等電點(diǎn)沉淀法

蛋白質(zhì)在等電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最?。?）等電點(diǎn)沉淀法溶解度mgN/mlpH4.85.05.25.45.612305mM1mM10mM20mMpH和鹽濃度對β－乳球蛋白溶解度的曲線

曲線上的數(shù)值為NaCl的濃度（3）低溫有機(jī)溶劑沉淀法

加入與水可混溶的中性有機(jī)溶劑，特別是甲醇、乙醇、丙酮可降低多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度并使之沉淀。3．根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性的分離方法（1）電泳法（2）離子交換層析法（1）電泳法1原理：由于各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下因分子量及荷電量不同使其電泳遷移率就不同。常用的是區(qū)帶電泳：所用支持物有濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂、淀粉、聚丙烯酰胺凝膠等。（1）電泳法2新近發(fā)展的等電聚焦區(qū)帶電泳。是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體放入電解槽中，通以直流電，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由正極到負(fù)極的逐漸增加的pH梯度。當(dāng)把蛋白質(zhì)樣品加入此系統(tǒng)時(shí)，帶正電的蛋白質(zhì)向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電的向正極移動(dòng)，直至達(dá)到其等電點(diǎn)的pH的位置。此時(shí)蛋白質(zhì)顆粒的凈電荷為零,也就不再向任何一極移動(dòng)，即聚集于其等電點(diǎn)的pH的位置。（1）電泳法3（平板電泳）（2）離子交換層析法陰離子交換劑或陽離子交換劑也可用于蛋白質(zhì)分離。陽離子交換樹脂含有的酸性基團(tuán)可解離出H+，當(dāng)溶液中含有其他陽離子時(shí)（如在酸性環(huán)境中的蛋白質(zhì)陽離子），它們可以和H+發(fā)生交換而“結(jié)合”在樹脂；相反，陰離子交換樹脂，可解離出OH－，能和溶液里的陰離子（如堿性環(huán)境中的帶負(fù)電的蛋白質(zhì)）發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。常用的陽離子交換劑有弱酸型的羧甲基纖維（CM－纖維素）。常用的陰離子交換劑有弱堿性的二乙氨基乙基纖維素（DEAE－纖維素）。RCHCOOHNH3++M1A+RCHCOOHNH3M1+A+

氨基酸（在酸性溶液中）陽離子交換劑

氨基酸鹽RCHCOO－NH2+M2B－RCHCOOM2NH2+B－

氨基酸（在堿性溶液中）陰離子交換劑

氨基酸鹽（2）離子交換層析法M1為酸性基團(tuán)，M2為堿性基團(tuán)4．根據(jù)配體特異性的分離方法1原理：利用蛋白質(zhì)分子能與其相對應(yīng)的配體進(jìn)行特異的、非共價(jià)的、可逆的結(jié)合來分離純化。配體：指能與某些蛋白質(zhì)進(jìn)行特異結(jié)合的化合物，如配體的作用物及抑制劑、激素和受體、抗原和抗體、酶及底物等。4．根據(jù)配體特異性的分離方法3親和色譜顆粒4．根據(jù)配體特異性的分離方法2首先需要制備有特異性配體的親和層析柱。一般可將配體連接在瓊脂糖顆粒上。蛋白質(zhì)樣品溶液通過此種特異的層析柱時(shí)，與此配體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)便被吸附而與其它物質(zhì)分開。再用某些試劑將蛋白質(zhì)與配體重新拆開而分離之。方法：三、蛋白質(zhì)的定量檢測1．凱氏定氮法2．雙縮脲法3．福林－酚試劑法4．紫外吸收法（二）定量檢測2(1凱氏定氮法1）原理：氮在蛋白質(zhì)分子中含量恒定（平均占16%），因此測出樣品中氮的含量后，即可求得樣品中蛋白質(zhì)含量。每克樣品中含氮的克數(shù)×6.25×100=100克樣品中蛋白質(zhì)的含量（克%）將蛋白質(zhì)樣品用濃H2SO4

消化分解（加熱、常加少量的硫酸銅、硫酸鉀作催化劑），使其中的氮轉(zhuǎn)變?yōu)殇@鹽，碳轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2，硫轉(zhuǎn)變?yōu)镾O2、SO3等逸出。銨鹽再與濃堿反應(yīng)，放出的氨被酸（硼酸）吸收，滴定剩余的酸，算出氮的含量。（二）定量檢測2(1凱氏定氮法2）NH3＋H3BO4HCl滴定(NH4)H2BO4NH4Cl+H3BO4（二）定量檢測2(2雙縮脲法）在堿性條件下，蛋白質(zhì)或多肽（雙縮脲的類似物）與硫酸銅反應(yīng)能產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，這種顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。將樣品同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)同時(shí)測定，并于540~560nm下比色，測光吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求蛋白質(zhì)的含量。此法簡便、迅速、但不太靈敏，所需樣品量大，一般在0.2~1.7mg/ml。（二）定量檢測2(3福林一酚試劑法）又叫Lowry法其原理是堿性銅試劑與蛋白質(zhì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，然后蛋白質(zhì)中的酚基（如酪氨酸）在堿性條件下很容易將混合試劑（含有磷鉬酸和磷鎢酸）還原或藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，在650~660nm下測定光吸收值，即可測定蛋白質(zhì)含量。此法比雙縮脲法靈敏100倍。蛋白質(zhì)測量范圍在25~250mg/ml，因此是通用的方法之一。但其受還原劑、EDTA、Tritonx-100及酚的影響，并且蛋白質(zhì)的種類不同，有較大的變動(dòng)。（二）定量檢測2(4紫外吸收法）由于蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，但各種蛋白質(zhì)中的這兩種氨基酸含量差別不大，所以在280nm吸收值與濃度成正比關(guān)系，可用于蛋白質(zhì)含量測定。此法準(zhǔn)確度較差，因?yàn)橛兄T多因素的干擾（如核酸），通常用280nm及260nm下的吸收差大概計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度

蛋白質(zhì)濃度mg/ml=1.45A280－0.74A260由于此法非常簡便，條件要求低，因此常作為粗略定量蛋白質(zhì)的方法來使用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中主鍵稱為

鍵，次級鍵有

、

、

、

、

；次級鍵中屬于共價(jià)鍵的是

鍵。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的基本類型有

、

、

和

。其中維持前三種二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定鍵的次級鍵為

鍵。蛋白質(zhì)水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，其穩(wěn)定性主要因素有兩個(gè)，分別是

和

。蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，所具有的主要特征是

、

。作業(yè)1．組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸依據(jù)什么分類？各類氨基酸的共同特性是什么？2．蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)與高級結(jié)構(gòu)之間存在的關(guān)系如何？3．何謂蛋白質(zhì)等電點(diǎn)？等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的存在特點(diǎn)是什么？4．哪些因素可引起蛋白質(zhì)變性？變性后蛋白質(zhì)的性質(zhì)有哪些改變？5．有哪些沉淀蛋白質(zhì)的方法？其中鹽析和有機(jī)溶劑沉淀法有何區(qū)別或特點(diǎn)？二、一級結(jié)構(gòu)的研究方法11.樣品必需純（>97%以上）。2.知道蛋白質(zhì)的分子量。3.知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成。4.測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。5.測定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的要求二、一級結(jié)構(gòu)的研究方法2（一）測定氨基酸的組成（二）蛋白質(zhì)的N-末端和C-末端的測定（三）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離（四）肽鏈的部分水解和肽段的分離（五）肽段的氨基酸順序的測定（六）二硫鍵位置的確定（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析1二硝基氟苯（DNFB）法（α-氨基反應(yīng)）Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析2二甲基氨基萘磺酰氯（稱丹磺酰氯）法在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達(dá)到110-9mol。（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析3異硫氰酸苯酯（PITC）法

此法最大優(yōu)點(diǎn)是除去N末端氨基酸后剩下的肽鏈部分仍是完整的。因此，可以用來一步步地測定多肽鏈N末端的氨基酸順序。氨基酸分析儀就是根據(jù)此原理制成的。NH2CH