多肽adwx-1在大鼠體內的藥動態(tài)變化

多肽adwx-1在大鼠體內的藥動態(tài)變化

類風濕性關節(jié)炎（ra）是一種以關節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身免疫性疾病。主要臨床表現為關節(jié)早僵硬、疼痛、腫脹和障礙。近年的研究表明T細胞表面鉀通道Kv1.3是治療T細胞介導自身免疫性疾病的藥物靶標,鉀通道Kv1.3調制劑特別是動物毒素多肽可以治療多發(fā)性硬化癥、Ⅰ型糖尿病、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、延遲型過敏反應蝎活性多肽ADWX-1是我國創(chuàng)新設計靶向T細胞鉀離子通道Kv1.3的治療風濕性關節(jié)炎多肽類候選藥物,分子質量為3.9k,作用于鉀通道Kv1.3的活性為1.8pM。它是目前公開報道作用鉀通道Kv1.3選擇性最強的多肽(作用鉀通道Kv1.1的IC本研究使用氯胺-T法將SD大鼠皮下單次給予不同劑量的ADWX-1后大鼠血漿中ADWX-1濃度,應用DAS軟件處理,進行藥代動力學參數分析,為進一步研究奠定基礎。11.1材料表面1.1.1主要試劑ADWX-1多肽,凍干粉,純度>99.0%(批號:20091218(4-1)、20091218(4-2)),上海新生源醫(yī)藥研究有限公司提供;1.1.2動物SD大鼠,清潔級,雌雄各半,體重220±20g,購自浙江省實驗動物中心,合格證號:SCXK(浙)20080033。1.1.3碘化鉀ki三氯乙酸(TCA),江蘇永華精細化學品有限公司;肝素,上海藍季科技發(fā)展有限公司,批號:090725;碘化鉀(KI),分析純,南京化學試劑有限公司;牛血清白蛋白(BSA),上?；菖d生化試劑有限公司,批號:070108;0.9%氯化鈉注射液,四川科倫藥業(yè)股份有限公司,批號:L1091016B;空白大鼠血漿,自制。1.1.4儀器SN-695B型智能放免γ測量儀(上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠,對1.2實驗方法1.2.1adwx-1生物活性檢測I-ADWX-1的放射化學純度測定將I-ADWX-1的生物活性測定由武漢大學生命科學院用全細胞膜片鉗法測定,在相同條件下比較1nmol/LADWX-1與1.2.2標準曲線、穩(wěn)定性和準確度測定方法:精密移取待測樣品(質控)溶液100μL,置于放免管中(各濃度均復管測量),使用SN-695Bγ測量儀測定各管的放射性計數60s;再向以上各管中加入等體積20%三氯乙酸(TCA),渦旋45s,4000r/min離心15min,棄上清,沉淀再用SN-695Bγ測量儀測定各管的放射性計數60s。標準曲線及測量范圍:精密稱取多肽ADWX-1適量,用0.9%NaCl注射液配置成25μg/mL(其中含精密移取A液100μL與900μL空白血漿混合,定容至1mL,得到濃度為2500ng/mL的標準溶液①,將上述標準溶液依次用空白血漿等比稀釋,配制成濃度分別為:1250ng/mL,625ng/mL,313ng/mL,156ng/mL,78ng/mL,39ng/mL的ADWX-1標準品溶液,分別標號為②-⑦。測定方法同上,以ADWX-1濃度(C)作為橫坐標、沉淀后放射性計數(cpm)為縱坐標進行線性回歸,繪制標準曲線。精密度及準確度:精密移取A液適量,用空白大鼠血漿稀釋成終濃度為2000ng/mL,313ng/mL,78ng/mL質控溶液,每個濃度各5個樣品,同批次測量,測量方法同上,計算日內精密度;同法連續(xù)測定3批,計算日間精密度。穩(wěn)定性考察:精密移取A液適量,用空白大鼠血漿稀釋成終濃度為2000ng/mL,313ng/mL,78ng/mL質控溶液,分別考察其在室溫放置0,1,2,4,8h;4℃條件下保存0,8,24,48h;-20℃條件下保存0,1,2,4d;反復凍融0,1,2,3次后的穩(wěn)定性變化情況,測定方法同上。穩(wěn)定性結果以測定濃度相對于設定濃度或者相對于0h時測定濃度的殘余百分數表示,計算公式為:殘余百分數(%)=測定濃度/加入濃度或者0h測定濃度×100。1.2.3臟器的注射取清潔級SD大鼠18只隨機分成3組,每組6只(雌雄各半),給藥前12h禁食、自由飲水,并腹腔注射1%KI溶液0.5mL封閉甲狀腺。分別腹部皮下注射給予高(200μg/kg)、中(100μg/kg)、低(50μg/kg)劑量的ADWX-1(其中高、中、低劑量均含22.1生物活性測定不同時段由以上結果可知:3個標記物中,(2)標記物(峰頂段)效果最好,其放射化學純度為96.77%,比活為645.20GBq/g,故采用(2)標記物進行生物活性測定及后期藥代動力學研究。I-ADWX-1的生物學活性測定結果見表2。在相同濃度下,多肽ADWX-1標記前及標記后對HEK293細胞鉀離子通道Kv1.3的電流抑制率分別為(73.05±4.53)%和(71.31±6.52)%,標記后的電流抑制率低于標記前,但二者無顯著性差異(2.2采用三氯乙酸沉淀法測定了sd大鼠血漿中adwx-1的濃度2.2.1準曲線的回歸方程以ADWX-1濃度(C)作為橫坐標、沉淀后放射性計數(cpm)作為縱坐標進行線性回歸,得到標準曲線的回歸方程為:Y(C)=8.163X-60.557,相關系數為0.9999。即ADWX-1濃度在39～2500ng/mL范圍內時,沉淀后放射性計數(cpm)與ADWX-1濃度(C)呈線性相關,線性關系良好,最低定量限31.2ng/mL,最低檢測限為19.5ng/mL。2.2.2精密度和回收率當大鼠血漿中ADWX-1的終濃度為2000ng/mL、313ng/mL和78ng/mL時,其日間、日內精密度及回收率實驗結果見表3。日內相對標準偏差為4.01%～5.24%,日間相對標準偏差為5.45%～10.03%,準確度為90.11%～92.67%,回收率為85.62%～88.31%。2.2.3穩(wěn)定性3種濃度的ADWX-1在4種條件下的殘余百分數為86.61%～107.10%,結果見表4。2.3平均血藥濃度-時間曲線及藥代動力學參數SD大鼠單次皮下給予200、100、50μg/kg的ADWX-1后的平均血藥濃度-時間曲線見圖1,主要藥代動力學參數見表3。由實驗結果可知,大鼠SC給予ADWX-1后的藥代動力學過程符合靜脈外給藥一房室模型一級動力學過程。3同位素示蹤法ADWX-1作為一種活性多肽,檢測這類蛋白質多肽藥物時往往受到諸如生物基質、基質內的蛋白水解、結合蛋白質以及其它許多物質的干擾,直接測定不夠準確,且靈敏度低,因此,這類藥物的臨床前藥代動力學研究常使用同位素示蹤法。而放射性同位