蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測定及性質(zhì)試驗(yàn)

-----總結(jié)-總結(jié)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測定及性質(zhì)試驗(yàn)一、目的：了解等電點(diǎn)的意義及其與蛋白質(zhì)分子聚沉力量的關(guān)系。初步學(xué)會(huì)測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的根本方法，了解蛋白質(zhì)的性質(zhì)。二、原理：固體顆粒在液體中為什么能夠帶電？當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體可以從溶液中選擇性吸附某種離子，也可以是固體分子本由于電中性的要求，帶電外表四周的液體中必有與固體外表電荷數(shù)量相等但符號相反的多余的反離子。在界面上帶電外表和反離子形成了雙電層的構(gòu)造。在兩種不同物質(zhì)的界面上，正負(fù)電荷分別排列成的面層。對于雙電層的具體構(gòu)造，一百多年來不同學(xué)者提出了不同的看法。最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910Gouy1913Chapman修正了平板型模型，提出了SternStern模型。依據(jù)O.斯特恩的觀點(diǎn)，一局部反離子由于電性吸引或非電性的特性吸引作用〔例如德華力〕而和外表嚴(yán)密結(jié)合，構(gòu)成吸附層〔或稱嚴(yán)密層、斯特恩層。其余的離子則集中地分布在溶液中，構(gòu)成雙電層的集中層〔或稱滑移面。由于帶電外表的吸引作用，在集中層中度與同號離子相等。吸附在固體外表上。其余反離子則構(gòu)成集中層。電勢差稱為ζ電勢。固體顆粒帶電量的大小及測量方式？ζ電勢只有在固液兩相發(fā)生相對移動(dòng)時(shí)才能呈現(xiàn)出來。ζZeta電位表示，pH值為橫坐標(biāo)，Zeta電位為縱坐標(biāo)作圖，ZetapH值即為等電點(diǎn)。對于蛋白質(zhì)分子來說：蛋白質(zhì)分子的大小在膠粒圍，約1～100微米。大局部蛋白質(zhì)分子的外表都有很多親水集會(huì)變得不穩(wěn)定，兩種因素都消退時(shí)，蛋白質(zhì)分子就會(huì)相互分散成較大的分子而產(chǎn)生沉淀。在質(zhì)的膠凝作用。3pH中的氨基酸分子氨基形成-NH+而帶正電，在堿性溶液中羧基形成-COO-而帶負(fù)電：3蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時(shí)的H值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。其定義為：在某一pH的溶液中，蛋白質(zhì)解離成陽離子和陰離子的趨勢或程度相等時(shí)，呈電中性，此時(shí)溶液的pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。等電點(diǎn)的應(yīng)用：主要用于蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)的分別、提純和電泳。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測量方式：溶解度最低時(shí)的溶液pH。-----總結(jié)-總結(jié)在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子在電場中不向任何一極移動(dòng)，而且分子與分子間因碰撞而引蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，最簡潔沉淀析出。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都不一樣，但偏酸性的較多，如牛的酪蛋白的等電點(diǎn)是4.7~4.86.7~6.85.3~5.4，魚精蛋白是一個(gè)典型的堿性蛋白，pH12.0~12.4。等電聚焦電泳〔IEF，isoelectricfocusingelectrophoresis〕pH等電聚焦電泳〔IEF，isoelectricfocusingelectrophoresis〕IEF的根本原理利用特別的一種緩沖液〔兩性電解質(zhì)〕在凝膠〔常用聚丙烯酰胺凝膠〕pH梯度，電泳時(shí)每種蛋白質(zhì)就將遷移到等于其等電點(diǎn)〔pI〕的pH處〔此時(shí)此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負(fù)電荷IEF的根本原理IEFpH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極，pH值漸漸增大。如前pHpH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)l。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動(dòng)，直到它們的等質(zhì)混合物參加有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場經(jīng)過肯定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自pH位置上，形成分別的蛋白質(zhì)區(qū)帶。體相互聚攏的現(xiàn)象。主要的沉淀現(xiàn)象有〔1〕鹽析：在蛋白質(zhì)水溶液中參加足量的鹽類〔如硫酸銨，可析出沉淀，稀釋后能溶解并仍保持原來的性質(zhì)，不影響蛋白質(zhì)的活性。這是一個(gè)可逆的過程，可用于蛋白質(zhì)的分別與初級提純〔2〕變性：在重金屬鹽、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加參加肯定量的溶劑如乙醇、丙酮，它們與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，破壞水化膜，短時(shí)〕參加生物堿試劑〔含氮的堿性物質(zhì)：能使生物堿沉淀或作用產(chǎn)生顏色0.8~1.2%25度水和有pH0.8~1.2%25度水和有機(jī)溶劑，溶于稀堿和濃酸中，能吸取水分。當(dāng)浸入水中則快速膨脹。在牛奶中以磷酸二鈣、三鈣或兩者的復(fù)合物形式存在。構(gòu)造極為簡單，沒有確定的分子式。分子量約為機(jī)溶劑，溶于稀堿和濃酸中，能吸取水分。當(dāng)浸入水中則快速膨脹。在牛奶中以磷酸二鈣、三鈣或兩者的復(fù)合物形式存在。構(gòu)造極為簡單，沒有確定的分子式。分子量約為3%80%。三、器材及試劑：器材：①試管×厘米〔。②吸管1毫升〔，2毫升〔，0毫升〔。③容量瓶0毫升〔0毫升〔。④試管架。試劑：①0.01mol·L-1醋酸溶液。③1mol·L-1醋酸溶液。

②0.1mol·L-1醋酸溶液。④1mol·L-1氫氧化鈉溶液〔氫氧化鈉和醋酸溶液的濃度要標(biāo)定。⑤酪蛋白。四、操作步驟：制備蛋白質(zhì)膠液340℃的蒸餾水。501mol·L-1氫氧化鈉溶液，微熱攪拌直到蛋白質(zhì)完全溶解為止。將500毫升容量瓶中，并用少量蒸餾水洗凈燒杯，一并倒入容量瓶。1mol·L-150毫升，搖勻。參加蒸餾水定容至500毫升，得到略現(xiàn)渾濁的，在0.1mol·L-1NaAC溶液中的酪蛋白膠體。等電點(diǎn)測定按下表挨次在各管中參加蛋白質(zhì)膠液，并準(zhǔn)確地參加蒸餾水和各種濃度的醋酸溶液，參加后馬上搖勻。0.01mol·L-10.1mol·L-11mol·L-1觀察HACHACHACpH010分20分(毫升)(毫升)〔毫升〕〔毫升〕分鐘鐘鐘118.380.62——5.9217.751.25——5.6318.75—0.25—5.3418.50—0.50—5.0518.00—1.00—4.7617.00—2.00—4.4715.00—4.00—4.1811.00—8.00—3.8917.40——1.603.5蛋白質(zhì)管膠液號H2O(毫升)蛋白質(zhì)管膠液號H2O(毫升)蛋白質(zhì)性質(zhì)試驗(yàn)蛋白質(zhì)的鹽析在試管里參加1~2毫升蛋白質(zhì)的水溶液，然后逐滴參加硫酸銨飽和溶液，觀看現(xiàn)象，有無白色渾濁產(chǎn)生。滴加過程中不要搖動(dòng)試管，現(xiàn)象不明顯時(shí)，多加幾滴硫酸銨飽和溶液。蛋白質(zhì)的變性在試管里參加25分鐘，觀看現(xiàn)象。把試管里的下層物質(zhì)取出一些放在水里，觀看現(xiàn)象。3毫升蛋白質(zhì)的水溶液，參加1毫升硫酸銅溶液，觀看現(xiàn)象〔有無淡藍(lán)色絮狀渾濁沉淀產(chǎn)生。把少量沉淀放入盛有蒸餾水的試管里，觀看沉淀是否溶解。五、思 考 題1、在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度為什么最低？請結(jié)合你的試驗(yàn)結(jié)果和蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)加以說明。(即正負(fù)電荷相等)，此時(shí)極易碰撞、分散而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。2、本試驗(yàn)中，酪蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)從溶