基因工程-第一章-核酸的制備課件

第一章核酸的制備Chapter1Preparationofnucleicacid第一章核酸的制備Chapter1Preparation核酸：遺傳信息的儲(chǔ)存物質(zhì)脫氧核糖核酸：deoxyribonucleicacid,DNA核糖核酸：ribonucleicacid,RNA區(qū)別：核酸：遺傳信息的儲(chǔ)存物質(zhì)脫氧核糖核酸：deoxyribonu第一節(jié)天然DNA的制備（PreparationofDNA）一、DNA的組成與結(jié)構(gòu)（CompositionandStructureofDNA）:Aphosphategrouplinkedbyaphosphodiesterbondtoapentose(afive-carbonsugarmolecule)thatinturnislinkedtoanitrogen-andcarbon-containingringstructurecommonlyreferredtoasa“base”.BasePentosePhosphateGroupNucleotide第一節(jié)天然DNA的制備（PreparationofDN主要堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)：主要堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：DNADNADNADNA解鏈溫度（Tm，meltingpoint）解鏈溫度（Tm，meltingpoint）DNA分子雜交(HybridizationofDNAstrandsfromdifferentsources)DNA分子雜交(HybridizationofDNAs環(huán)狀DNA（CircularDNA）超螺旋DNA（supercoiledDNA，SC-DNA）；共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（CovalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）；開(kāi)環(huán)DNA（opencircleDNA，oc-DNA）；線形DNA（linearDNA，L-DNA）環(huán)狀DNA（CircularDNA）超螺旋DNA（supe二、天然DNA的提?。≒urificationofDNA）(一)生物材料的準(zhǔn)備（PreparationofMaterial）：1.DNA的保存：1.1.70%的乙醇（Ethanol）1.2.TE溶液（Tris-Cl10mmol/LpH8.0，EDTA1mmol/L）1.3.低溫二、天然DNA的提?。≒urificationofDNA2.大腸桿菌（E.coli）常見(jiàn)抗生素（Antibiotics）的使用：2.1氨芐青霉素（ampicillin，Ap）：抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成，50～150μg/mL（水溶液）；2.2鏈霉素（streptomycin，Sm）：與細(xì)菌核糖體30S亞單位結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)(酶)的合成,使細(xì)菌不能正常生長(zhǎng)或者代謝而死亡，25～50μg/mL（水溶液）；2.3四環(huán)素（tetracycline，Tc）：與細(xì)菌核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，干擾核糖體上密碼子與反密碼子的相互作用，從而阻止氨酰基tRNA同核蛋白體結(jié)合，5mg/mL（乙醇溶液）；2.4氯霉素（chloramphenicol，Cm）：與細(xì)菌核蛋白體50S亞基結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，從而抑制蛋白質(zhì)合成，20μg/mL（乙醇溶液）；2.5卡那霉素（knamycin，Km）：與細(xì)菌核蛋白體蛋白基結(jié)合，并與較小的RNA亞基編譯區(qū)的特定堿基結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)合成，25～50μg/mL（水溶液）；2.大腸桿菌（E.coli）常見(jiàn)抗生素（Antibioti(二)裂解細(xì)胞（Celllysis）：1.化學(xué)方法：1.1CTAB裂解法：CTAB（cetyltriethyammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），陽(yáng)離子去污劑，與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液（＞0.7mol/LNaCl）中穩(wěn)定，在低鹽溶液（≤0.3mol/LNaCl）中沉淀。1.2SDS裂解法：SDS（sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸鈉），陰離子去垢劑，蛋白質(zhì)變性劑，有效沉淀多糖，與K離子形成絮狀沉淀，廣泛用于質(zhì)粒（plasmid）DNA的提取，蛋白質(zhì)的分離純化。(二)裂解細(xì)胞（Celllysis）：2.酶裂解方法：2.2蛋白酶K（ProteinaseK）裂解法：用于水解蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合緊密的組蛋白（Histone），廣泛用于動(dòng)物組織基因組DNA的提取，通常與SDS，Tris-Cl及EDTA共同裂解細(xì)胞。2.3溶菌酶（lysozyme）裂解法：通常用于細(xì)菌裂解，提取質(zhì)粒DNA，其原理是破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖支架，通過(guò)低滲透壓使細(xì)胞脹裂，引起細(xì)胞裂解。作用條件溫和，pH6.0～7.0，室溫25℃。2.酶裂解方法：（三）DNA的分離和抽提1.酚-氯仿抽提法：苯酚（phenol）-氯仿（chloroform）-異戊醇（isoamylalcohol）比例：25:24:1，苯酚：蛋白質(zhì)變性劑；氯仿：蛋白質(zhì)變性劑；并使變性的蛋白質(zhì)從水相層分離；異戊醇：防止產(chǎn)生泡沫。（三）DNA的分離和抽提1.酚-氯仿抽提法：2.氯化銫密度梯度離心法(CsCldensitygradientcentrifugation)；3.固相萃取法(solidphaseextraction,SPE)；2.氯化銫密度梯度離心法(CsCldensitygra離心技術(shù)在基因工程中的應(yīng)用（ApplicationofCentrifugationtechniques）離心技術(shù)在基因工程中的應(yīng)用（ApplicationofC（四）DNA的純化（purification）和濃縮（condense）1.DNA的純化：1.1Rnase處理，去除RNA；1.2離子交換層析法；1.3氯化銫密度梯度離心法；1.4瓊脂糖電泳洗脫法；（四）DNA的純化（purification）和濃縮（con瓊脂糖電泳（Agarosegelelectrophoresis）1.安放好制膠模具（梳子和膠槽）瓊脂糖電泳（Agarosegelelectrophore2.瓊脂糖凝膠澆灌并冷凝2.瓊脂糖凝膠澆灌并冷凝3.移走梳子，暴露出上樣孔3.移走梳子，暴露出上樣孔4.瓊脂糖膠放置在電泳緩沖液中4.瓊脂糖膠放置在電泳緩沖液中5.上樣，通電流，直至DNA遷移到適當(dāng)位置5.上樣，通電流，直至DNA遷移到適當(dāng)位置6.在紫外光（UV）下觀察DNA電泳情況6.在紫外光（UV）下觀察DNA電泳情況DNA電泳完畢后的瓊脂糖凝膠DNA電泳完畢后的瓊脂糖凝膠在紫外光（UV）下觀察DNA電泳情況在紫外光（UV）下觀察DNA電泳情況不同凝膠的DNA電泳情況瓊脂糖凝膠（agarose）聚丙烯酰胺凝膠凝膠（PAGE）不同凝膠的DNA電泳情況瓊脂糖凝膠（agarose）聚丙烯酰電泳儀（電源和電泳槽）電泳儀（電源和電泳槽）離子交換柱層析純化DNA離子交換柱層析純化DNA2.DNA的濃縮：2.1乙醇（Ethanol）沉淀法；2.2正丁醇（butylalcohol）抽提法；2.3聚乙二醇（PEG6000）濃縮法；2.DNA的濃縮：第三節(jié)人工合成核酸片段二、核酸的酶法合成PCR反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：模仿細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過(guò)程，在體外有酶催化合成特異性DNA片段。第三節(jié)人工合成核酸片段二、核酸的酶法合成PCR技術(shù)簡(jiǎn)史1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……PCR技術(shù)簡(jiǎn)史1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性PCR技術(shù)簡(jiǎn)史1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)PCR技術(shù)簡(jiǎn)史1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mull1.PCR的基本原理(MechanismofPCR)類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。其原理是通過(guò)高溫變性模板、引物與模板退火、引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以幾何級(jí)數(shù)倍增。1.PCR的基本原理(MechanismofPCR)5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA555555555Primer15Primer2Cycle2CycCycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。Cycle35555555555（3）PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C（3）PCR的基本反應(yīng)步驟變性延伸退火PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：

10X緩沖液（Buffer）10μL4種dNTP混合物各200umol/L引物（Primer）各10～100pmol模板DNA（Template）0.1～2μgTaqDNA聚合酶0.5～

2.5UMg2+

1.5mmol/LPCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：10X緩沖液（Buffer）PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)70-75℃90-94℃37-60℃PCR循環(huán)70-75℃90-94℃37-60℃PCR循環(huán)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍37-60℃90-95℃70-75

℃1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)PCR擴(kuò)增No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 220=1,048,57630 230=1.07X1071cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR擴(kuò)增No.of No.AmpliconCyclPCR反應(yīng)特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU（空斑形成單位）

細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR反應(yīng)特點(diǎn)靈敏度高（1）TaqDNA聚合酶（2）

PwoDNA聚合酶（3）TthDNA聚合酶（4）C.therm聚合酶4.2.1耐熱性DNA聚合酶（1）TaqDNA聚合酶4.2.1耐熱性DNA聚合酶（1）TaqDNA聚合酶1986年從一種75℃熱泉中的細(xì)菌(Thermusaquaricus)中分離純化出來(lái)的。95kDa，單分子酶，75℃活性最強(qiáng)。具有5’-3’合成活性和5’-3’外切活性,無(wú)3’-5’外切活性。95℃時(shí)半衰期為40分鐘。啟動(dòng)PCR反應(yīng)的能力很強(qiáng)，聚合速度快，在72℃的聚合速度為每秒30-100堿基。由于沒(méi)有3'-5'外切活性，在擴(kuò)增過(guò)程中有8.9-11x10-5

的錯(cuò)配率。（1）TaqDNA聚合酶（2）PwoDNA聚合酶來(lái)自古細(xì)菌Pyrococcuswoesei，由德國(guó)寶靈曼公司開(kāi)發(fā)（BM），

90kDa，100℃的半衰期大于2小時(shí)，具有3’-5’外切活性，出錯(cuò)率低，使用較多的的且具有高保真度的PCR酶。（2）PwoDNA聚合酶（3）TthDNA聚合酶

來(lái)自嗜熱熱細(xì)菌（Thermusthermophilus），由Promega公司開(kāi)發(fā)成商品。94kDa，95℃的半衰期為20分鐘。在Mg2+存在條件下以DNA為模板合成DNA，而在Mn2+存在下可以RNA為模板合成cDNA。因此可在高溫下做RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄PCR）反應(yīng)，避免RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

（3）TthDNA聚合酶

來(lái)自嗜熱熱細(xì)菌（Thermus（4）C.therm聚合酶來(lái)自Carboxydothermushudrogenoformans，以Mg2+為輔助因子的逆轉(zhuǎn)錄酶，最適溫度適60-70℃，同時(shí)也具有3’-5’外切酶校對(duì)活性，用于RT-PCR

反應(yīng)。（4）C.therm聚合酶4.2.2靶DNA/模板單、雙鏈DNA均可。純度：不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。使用濃度：一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。其兩端20-30bp序列用以一對(duì)引物的設(shè)計(jì)。4.2.2靶DNA/模板單、雙鏈DNA均可。①引物長(zhǎng)度18～30bp，過(guò)短則降低特異性，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起引物間的退火而影響有效擴(kuò)增，同時(shí)也增加引物合成的成本。②避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補(bǔ)序列（3個(gè)堿基），避免序列內(nèi)有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，減少引物二聚體的形成以及引物內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。③G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。4.2.3PCR引物①引物長(zhǎng)度18～30bp，過(guò)短則降低特異性，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起引物④引物3’末端堿基應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，并且3’末端為G、C時(shí)引發(fā)效率較高。⑤引物5’末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無(wú)關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列、ATG起始密碼子或啟動(dòng)子序列等)，便于克隆和表達(dá)。⑥引物用核酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性，引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。④引物3’末端堿基應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，并且3’末端為G、4.2.4PCR原材料dNTP脫氧核苷三磷酸四種dNTP濃度應(yīng)相等要求：濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量4.2.4PCR原材料dNTP脫氧核苷三磷酸4.2.5PCR緩沖液成分：10mmol/LTris-HCl(pH8.8室溫下)，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2。Mg2+：是DNA聚合酶的激活劑，0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性4.2.5PCR緩沖液成分：10mmol/LTris-4.2.6PCR循環(huán)的溫度和時(shí)間溫度:90-95℃模板變性，復(fù)性（37-60℃），溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定；70-75℃引物在模板上延伸反應(yīng)時(shí)間變性30s，如果模板G+C含量高，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。復(fù)性30s。延伸1kb1min充足，由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定。循環(huán)次數(shù)

25～35

次。4.2.6PCR循環(huán)的溫度和時(shí)間溫度:25μLPCR反應(yīng)體系：模板DNA1μL（10－100ng）引物11μL（10μmol/L）引物21μL（10μmol/L）dNTP（10mmol/L）1μL（20mmol/L）10×PCR反應(yīng)的緩沖液2.5μLTaq酶0.5μL（1U/μl）ddH2O補(bǔ)至25μL4.3PCR擴(kuò)增DNA片段的方法常規(guī)程序25μLPCR反應(yīng)體系：4.3PCR擴(kuò)增DNA片段的方PCR反應(yīng)的程序：溫度（℃）時(shí)間（分鐘）(1)953-5(2)950.5(3)600.5(4)721(5)721025－30個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)的程序：25－30個(gè)PCR反應(yīng)的操作注意事項(xiàng)：1）加樣操作必須在冰上進(jìn)行；2）加樣的順序：（1）從大到??；（2）先加藥品再酶：PCR反應(yīng)結(jié)果異常及解決辦法：1）無(wú)帶；2）雜帶多；3）DNA降解。PCR反應(yīng)的操作注意事項(xiàng)：PCR中應(yīng)注意的事項(xiàng)

防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開(kāi)，無(wú)菌操作設(shè)立對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性模板陰性對(duì)照：陰性模板試劑對(duì)照：除模板外的所有組分PCR中應(yīng)注意的事項(xiàng)防止污染4.4PCR技術(shù)應(yīng)用

4.4.1PCR技術(shù)的主要類型反向PCR錨定PCR不對(duì)稱PCR原位PCRRT-PCR重組PCR差異顯示PCR免疫PCR實(shí)時(shí)定量PCR多重PCR4.4PCR技術(shù)應(yīng)用

4.4.1PCR技術(shù)的主要類型反1)反向PCR(reversePCR)方法：對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。用途：探索鄰接已知DNA片段的未知序列；建立基因組步移文庫(kù)。已知序列未知序列未知序列1)反向PCR(reversePCR)方法：對(duì)某個(gè)已知已知序列未知序列未知序列連接酶已知序列未知序列未知序列連接酶2）不對(duì)稱PCR(asymmetricPCR)

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物，最佳比例一般是0.01∶0.5μM。

用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究2）不對(duì)稱PCR(asymmetricPCR)

高濃度引物低濃度引物高濃度引物低濃度引物3）RT－PCR:方法：以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作模板所進(jìn)行的PCR反應(yīng),用途：測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度和鑒定已轉(zhuǎn)錄序