常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)課件

光鏡下觀察組織標(biāo)本需克服的幾個(gè)問題

如何保持組織標(biāo)本取材前的形態(tài)？如何制備薄組織片，允許光的通過而便于觀察？如何使不同組織結(jié)構(gòu)具有不同的光折射率，便于對標(biāo)本進(jìn)行結(jié)構(gòu)的仔細(xì)辨別？光鏡下觀察組織標(biāo)本需克服的幾個(gè)問題如何保持組織標(biāo)本取材前1光鏡標(biāo)本的基本制作技術(shù)第二章光鏡標(biāo)本的基本制作技術(shù)第二章2光鏡樣本的基本制作技術(shù)（組織制片技術(shù)）是醫(yī)學(xué)研究和生物學(xué)研究中，觀察細(xì)胞、組織的正?；虿±硇螒B(tài)變化的一種必不可少的手段，借此可以彌補(bǔ)活體觀察的不足同時(shí)光鏡樣本的基本制作技術(shù)也是其它光鏡標(biāo)本技術(shù)的基礎(chǔ)光鏡樣本的基本制作技術(shù)（組織制片技術(shù)）是醫(yī)學(xué)3取材固定漂洗脫水透明浸蠟包埋切片脫蠟

染色脫水透明封片光鏡樣本的制作的基本過程取材固定4第一節(jié)取材及固定醫(yī)學(xué)研究的組織樣本來源人體（最好）臨床的活檢組織尸檢組織（取材方法及注意事項(xiàng)按病理學(xué)要求進(jìn)行）正常組織用正常動(dòng)物的組織材料替代第一節(jié)取材及固定醫(yī)學(xué)研究的組織樣本來源5一、動(dòng)物致死法

動(dòng)物的福利，3R原則

動(dòng)物致死法選擇致死動(dòng)作應(yīng)迅速一、動(dòng)物致死法動(dòng)物的福利，3R原則6常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件71．?dāng)囝^法2．擊頭法3．麻醉法4．股動(dòng)脈放血法5．空氣栓塞法動(dòng)物致死方法1．?dāng)囝^法動(dòng)物致死方法8細(xì)胞標(biāo)本制備1.印片法2.穿刺法3.沉淀法4.培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本制備細(xì)胞標(biāo)本制備1.印片法9二、取材及注意事項(xiàng)1．材料保持新鮮2．組織塊免受擠壓3．組織塊力求小而薄4．盡量保持組織的原有形態(tài)5．選取好組織塊的切面6．動(dòng)物品種的選擇和熟悉取材的解剖位置7．切除不需要的部分8．保持材料的清潔二、取材及注意事項(xiàng)1．材料保持新鮮10三、組織固定法

固定是使要觀察的組織構(gòu)造盡量接近它取材前的狀態(tài)三、組織固定法固定是使要觀察的組織構(gòu)造盡量接11（一）固定目的1．標(biāo)本不發(fā)生離開身體后或死后變化2．隨后處理中，標(biāo)本不易損壞3.組織塊硬化4．使組織內(nèi)各種結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的折光率，或?qū)θ玖暇哂胁煌挠H和力（一）固定目的12

（二）固定方法1．蒸氣固定法（較細(xì)小而薄的標(biāo)本）2．小塊組織固定法（直接投入固定液中）3．注射、灌注固定法（體積過大或固定液極難滲入內(nèi)部的組織標(biāo)本）（1）局部灌注固定（肺、肝、腎、腦等）（2）全身灌注固定（小鼠、大鼠、兔、狗、猴、人）4.微波固定法（二）固定方法13常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件14

灌注過程充分暴露心臟針尖插入左心室或升主動(dòng)脈中快速灌注生理鹽水剪開右心耳（或右心房）放血換灌固定液，先快后慢輸入灌注過程15

用量1.生理鹽水大鼠需用80-100ml、兔150-200ml、貓200-250ml、猴300-500ml、狗800-1000ml2.固定液動(dòng)物血液量的2倍動(dòng)物體重（g）×7%×20（ml）用量16

無論是局部灌注固定，還是全身灌注固定，在灌注完畢后，必須立即將組織塊、器官或整個(gè)動(dòng)物再放入同樣的固定液中進(jìn)行后固定無論是局部灌注固定，還是全身灌注固定，在灌注171．組織塊不宜過大2．軟組織或較大塊組織可先經(jīng)2~3小時(shí)固定后，再修整成小塊重投入新配制的固定液內(nèi)繼續(xù)固定3．固定液的量是組織塊大小的5-20倍為宜，在固定組織的瓶底墊上脫脂棉、數(shù)層紗布或?yàn)V紙4．固定時(shí)間的長短視固定劑的種類、溫度、組織塊的大小而定（三）固定注意事項(xiàng)及影響因素1．組織塊不宜過大（三）固定注意事項(xiàng)及影響因素181．甲醛（福爾馬林）：商品甲醛的濃度是37%~40%的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液濃度是10%，而實(shí)際甲醛濃度只有4%固定小塊組織(15×15×2mm)10小時(shí)左右經(jīng)它長期固定的組織，需經(jīng)24~48小時(shí)的自來水流水沖洗四、固定液（一）單純固定液1．甲醛（福爾馬林）：商品甲醛的濃度是3719

甲醛單純固定液的常用配方10%甲醛水溶液37%-40%甲醛液10ml自來水或蒸餾水90ml10%甲醛生理鹽水溶液37%-40%甲醛液10ml氯化鈉0.85g自來水或蒸餾水90ml甲醛單純固定液的常用配方20

2．多聚甲醛：一種滲透速度極快的甲醛聚合物，在熱水中可解聚成甲醛單體而溶解，在接近水的沸點(diǎn)時(shí)溶解極快；也可溶解于弱堿中。多聚甲醛溶液實(shí)際上是新配制的甲醛液，宜臨用前配制2．多聚甲醛：一種滲透速度極快的甲醛聚合物，21

4%多聚甲醛單純固定液的常用配方

多聚甲醛4g蒸餾水（或0.2mol/LPB）50ml在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱使之完全溶解，然后冷卻0.2mol/LPB（或蒸餾水）～100ml

4%多聚甲醛單純固定液的常用配方22

3．戊二醛：一種常用的醛類固定劑，能較好的保存組織結(jié)構(gòu)，但其穿透力弱，作為單純固定液多用于電鏡技術(shù)中。市售的戊二醛是25%的溶液，使用時(shí)需配制成1%~6%的不同濃度3．戊二醛：一種常用的醛類固定劑，能較好的23

4．酒精：單純固定液為80%~95%的濃度，不必水洗而直接脫水。多用于組織化學(xué)中的糖原固定酒精固定的組織易變硬和發(fā)脆、組織收縮較大，所以不易長時(shí)間停留其中（70%酒精除外）可作為配制混合固定液的基本成分4．酒精：單純固定液為80%~95%的濃度，245．其它固定液丙酮苦味酸醋酸重鉻酸鉀三氯醋酸鉻酸氯化汞鋨酸5．其它固定液25

用多種具有固定作用的試劑混合配制的固定液，達(dá)到各試劑在固定作用中具有的優(yōu)缺點(diǎn)平衡目的（二）混合固定液用多種具有固定作用的試劑混合配制的固定液，達(dá)26常用混合固定液1．酒精-甲醛液（A-F液）95%或無水酒精（A）90ml37%~40%甲醛液（F）10ml2．Carnoy液冰醋酸10ml氯仿30ml無水酒精60ml3．Bouin液飽和苦味酸水溶液75ml甲醛液（37%~40%）25ml冰醋酸5ml常用混合固定液1．酒精-甲醛液（A-F液）27

4．Helly液重鉻酸鉀2.5g升汞5g蒸餾水100ml（以上是Helly儲(chǔ)存液）甲醛液(37%~40%)(臨用時(shí)加入)5ml5．1%多聚甲醛-1.25%戊二醛固定液多聚甲醛1g蒸餾水50ml在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱使之完全溶解，然后冷卻25%戊二醛5ml0.2mol/LPB（pH7.4）～100ml4．Helly液28第二節(jié)固定后處理及切片一、組織修整固定結(jié)束后，將受擠壓或不需要的部分組織修切或整形，同時(shí)選擇好包埋面，稱組織修整。修整可在沖洗前、也可放在沖洗后第二節(jié)固定后處理及切片一、組織修整29二、組織洗滌洗去滲入組織內(nèi)的固定液，再進(jìn)行下一步驟的操作；否則會(huì)妨礙染色效果，或引起沉淀、結(jié)晶而影響觀察，也可能會(huì)繼續(xù)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)造成后道操作困難1．水洗滌法：凡用水配制、或含鉻、鋨等的固定液所固定的組織塊，需用水洗滌2．酒精洗滌法：凡用酒精、或酒精混合液、或含有苦味酸等固定液固定的組織塊，多采用酒精洗滌二、組織洗滌洗去滲入組織內(nèi)的固定液，再進(jìn)行下30三、組織脫水（一）脫水意義與脫水劑因水和石蠟不能相溶，而組織經(jīng)固定及水洗后含有水分，所以不能直接用石蠟進(jìn)行包埋。需用某些溶劑逐步置換組織塊中的水分，稱脫水脫水劑必須具有下列特性：1）脫水劑能與水按任意比例混合；2）脫水劑高濃度時(shí)不含水分；3）脫水劑也能與透明劑按任意比例互相混合三、組織脫水（一）脫水意義與脫水劑31脫水劑中最常用的是酒精。一般從70%酒精開始脫水，逐步升高酒精濃度；脫水時(shí)間根據(jù)組織塊的種類、大小、及使用的固定液種類等因素而定脫水劑中最常用的是酒精。3270%酒精2~5小時(shí)(可長期保存組織)80%酒精2~5小時(shí)90%酒精2~5小時(shí)95%酒精（Ⅰ）2~5小時(shí)95%酒精（Ⅱ）2~5小時(shí)無水酒精（Ⅰ）30分鐘無水酒精（Ⅱ）30分鐘無水酒精（Ⅲ）30分鐘（二）脫水步驟和時(shí)間以18mm×18mm，厚約2~3mm的組織塊為例，其脫水步驟和參考時(shí)間如下70%酒精2~33（三）脫水注意事項(xiàng)

1．組織脫水必須掌握由低濃度逐步過渡到高濃度的原則2．脫水時(shí)間要適度3．組織脫水要徹底干凈（三）脫水注意事項(xiàng)34四、透明（一）透明意義及透明劑組織脫水后，內(nèi)部僅含脫水劑，但大多數(shù)脫水劑不能與石蠟相溶，石蠟仍不能浸入組織內(nèi)進(jìn)行包埋和切片。為此，需要一種既能溶于脫水劑又能溶于包埋劑（石蠟）的溶劑，以便逐步將脫水劑置換成包埋劑。這一過程往往使組織呈半透明狀，故稱透明二甲苯為石蠟包埋法中最常用的透明劑；它透明能力強(qiáng)，但易使組織收縮、變脆，故組織塊的透明時(shí)間不宜太長，小組織塊以30分鐘為宜，較大組織塊適當(dāng)延長但不超過2小時(shí)四、透明（一）透明意義及透明劑35（二）透明步驟和時(shí)間

為了減少組織塊過度收縮，往往在無水酒精之后，先經(jīng)過酒精和二甲苯的混合液，然后再浸入純二甲苯中透明步驟和時(shí)間大致如下1．無水酒精:二甲苯=1:120~30分鐘2．二甲苯（Ⅰ）20~30分鐘3．二甲苯（Ⅱ）20~30分鐘（二）透明步驟和時(shí)間36（三）透明注意事項(xiàng)二甲苯必須保持無水組織塊脫水過程要徹底（三）透明注意事項(xiàng)37五、浸蠟（一）浸蠟?zāi)康?/p>

浸蠟是將透明過的組織塊在熔化的石蠟中浸漬的過程。目的是用石蠟代替組織塊中的二甲苯，在隨后溫度下降中，使較軟的組織塊變成有一定硬度的組織蠟塊，以便切片機(jī)切片五、浸蠟（一）浸蠟?zāi)康?8

第1杯熔蠟(軟蠟)(熔點(diǎn)54℃以下)1小時(shí)第2杯熔蠟(硬蠟)(58~60℃)1小時(shí)第3杯熔蠟(硬蠟)(58~60℃)30分鐘整個(gè)浸蠟時(shí)間控制在3小時(shí)之內(nèi)浸蠟在恒溫箱中進(jìn)行，且恒溫箱溫度高于石蠟熔點(diǎn)2~3℃（二）浸蠟的步驟第1杯熔蠟(軟蠟)(熔點(diǎn)54℃以下)39（三）浸蠟注意事項(xiàng)

1．浸蠟最佳溫度應(yīng)是石蠟剛?cè)刍?、或蠟杯底部尚殘留小部分未熔完蠟時(shí)的溫度2．浸蠟中一般采用浸蠟籃浸蠟法，把組織塊和標(biāo)簽一齊裝入分格籃內(nèi)浸蠟3．石蠟應(yīng)在加熱的條件下過濾除去雜質(zhì)4．浸蠟用的石蠟要定期更換5．新石蠟應(yīng)在使用前放在溫箱內(nèi)熔化一次，使其中的揮發(fā)性物質(zhì)蒸發(fā)6．包埋結(jié)束后應(yīng)將熔蠟從溫箱內(nèi)取出，以免石蠟無益地加溫熔化（三）浸蠟注意事項(xiàng)40常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件41六、包埋（石蠟包埋法）（一）包埋目的及包埋劑

包埋是將某些特殊的支持物質(zhì)浸入到組織塊內(nèi)部，利用支持物質(zhì)的物理特性，將整個(gè)組織加以包埋，最后凝固成均勻一致的較硬固態(tài)結(jié)構(gòu)，以便切片機(jī)制備極薄切片石蠟是組織學(xué)切片技術(shù)中最常用的包埋劑六、包埋（石蠟包埋法）（一）包埋目的及包埋劑42（二）包埋過程1．取預(yù)熱包埋框及金屬板，搭成包埋模具2.迅速傾注少量熔蠟于包埋框中3.從蠟杯中夾取組織塊，切面向下置于框底4.加熔蠟至包埋框上緣，將標(biāo)簽紙緊貼旁邊5.表面熔蠟?zāi)Y(jié)至一定厚度時(shí)，慢慢浸入冷水中（夏天用冰水）急速凝固6.凝結(jié)蠟塊自動(dòng)漂浮于水面，或30分鐘后推開包埋框，取出蠟塊。7.修塊（二）包埋過程43常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件44（三）包埋注意事項(xiàng)

1．包埋蠟的熔點(diǎn)選擇2．石蠟脆性大時(shí)，可加蜂蠟提高韌性3．包埋用石蠟和最后浸蠟的石蠟熔點(diǎn)要相同4．包埋中組織塊間要有一定距離5．石蠟?zāi)桃焖伲ㄈ┌褡⒁馐马?xiàng)45常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件46七、切片（一）石蠟切片機(jī)及切片刀1．石蠟切片機(jī)最常用的石蠟切片機(jī)是輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，它的切片刀固定不動(dòng)，而靠右側(cè)旋轉(zhuǎn)的重輪帶動(dòng)螺紋軸和齒輪，將組織塊夾具按所調(diào)節(jié)的切片厚度向前推進(jìn)，并在上下平面運(yùn)動(dòng)，讓組織塊經(jīng)過前下方切片刀而切成一定厚度的切片七、切片（一）石蠟切片機(jī)及切片刀47常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件48

2．切片刀與磨刀石蠟切片常用的切片刀為平楔型切片刀，也有一次性切片刀非一次性使用的切片刀在切片前需要研磨，以保持其鋒利；研磨刀可分為手工研磨刀和機(jī)械研磨刀（磨刀機(jī)）兩種2．切片刀與磨刀49常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件50常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件51常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件52（二）石蠟切片過程1．修塊2．蠟塊和切片刀固定3．調(diào)整蠟塊切面和切片刀角度(10°以內(nèi))4.調(diào)整刀臺與標(biāo)本臺距離5.修整蠟塊切面，暴露完整組織切面6.調(diào)整切片厚度調(diào)節(jié)器(厚度為6~8μm)7.正式切片8．切片展平9．貼片和烘片（二）石蠟切片過程53常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件54常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件55常規(guī)石蠟制片HE染色技術(shù)ppt課件56

（1）切片碎卷狀：脫水、透明或浸蠟時(shí)間長、浸蠟溫度高（2）蠟片卷曲：刀口不鋒利或臟、刀角傾斜過度、石蠟過硬（3）切片不成蠟帶：室溫低、石蠟過硬、蠟塊上下邊過小或不平（4）蠟帶彎曲：蠟塊的兩側(cè)大小不等、刀口不鋒利（5）切片皺褶：石蠟過軟、浸蠟不完全、刀的傾斜角度過?。?）切片厚薄不均：刀口不鋒利、切片機(jī)性能不佳、刀架或刀或蠟塊未固定牢（7）切片出現(xiàn)縱紋：刀刃有缺口、石蠟或組織的硬度不一（8）切片出現(xiàn)橫紋：蠟塊、刀或刀架未固定好（9）切片粘刀：刀鋒沾污、刀的傾斜角度過小、刀口不鋒利（10）蠟塊底邊呈白色：刀的傾斜角度過小（11）切片粘蠟塊：刀純、刀口不潔、室內(nèi)溫度高、太干燥（三）切片過程中常遇問題及可能造成原因（1）切片碎卷狀：脫水、透明或浸蠟時(shí)間長、浸蠟溫度高（三57第三節(jié)蘇木素-伊紅染色方法染色是將組織浸入染料配制的染色液中，使組織中的不同結(jié)構(gòu)染上不同顏色或不同深淺的顏色，從而產(chǎn)生不同的折射率，便于在光鏡下清楚地顯示組織內(nèi)部各種構(gòu)造第三節(jié)蘇木素-伊紅染色方法染58

染料是一類有色的以苯環(huán)為基礎(chǔ)的有機(jī)化合物，它不同于一般顏料，因?yàn)樗坏蓄伾?，更重要的是它對組織的不同成份具有不同的親和力。構(gòu)成染料至少必須有兩種原子團(tuán)連接于苯環(huán)上，即能使染料顯色的原子團(tuán)-發(fā)色團(tuán)和能使染料對不同組織具有不同親和力及加深顏色的原子團(tuán)（酸、堿性基團(tuán)）-助色團(tuán)染料是一類有色的以苯環(huán)為基礎(chǔ)的有機(jī)化59

分類

細(xì)胞核染料有天然染料蘇木素、胭脂紅及人工合成的染料結(jié)晶紫、甲苯胺藍(lán)、甲基綠、美藍(lán)、焦油紫等

細(xì)胞質(zhì)染料有人工合成的伊紅Y、酸性復(fù)紅、苦味酸、水溶性苯胺藍(lán)等分類60媒染劑為有些二價(jià)或三價(jià)金屬物質(zhì)，如鋁、鐵、銅、鎢等可作為中介媒體物質(zhì)，使原來幾乎不與組織結(jié)合或結(jié)合能力很弱的部分染料（尤其是天然染料）著色；它主要是通過增加染料對組織中某一成份的親和能力，自身又與染料或組織發(fā)生結(jié)合而發(fā)揮作用媒染劑為有些二價(jià)或三價(jià)金屬物質(zhì)，如鋁61

助染劑（促染劑）與媒染劑不同，它只加強(qiáng)染料的染色能力，而自身不參與染色反應(yīng)分化劑（脫色劑、分色劑）用于退行性染色法中脫去組織過染的染料，降低著色顏色

酸性分化劑0.5~1%的鹽酸酒精（95%以下）或較稀的冰醋酸水溶液

氧化分化劑苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、過錳酸鉀等

媒染分化劑既能促使組織和染料結(jié)合，又可使已經(jīng)結(jié)合到組織上的染料脫離助染劑（促染劑）與媒染劑不同，它只加強(qiáng)染62一、蘇木素-伊紅染色的基本原理

蘇木素和伊紅染色是組織學(xué)中常規(guī)制片中最基本，也是應(yīng)用最廣泛的染色方法，故稱常規(guī)染色（簡稱HE染色）

一、蘇木素-伊紅染色的基本原理蘇木素63

蘇木素（或蘇木精）是一種天然的染料，易溶于酒精而微溶于水，是較好的細(xì)胞核堿性染料，并可將細(xì)胞中不同的結(jié)構(gòu)分化出各種不同的顏色；蘇木素分子須經(jīng)氧化形成蘇木紅分子，才具有真正的染色能力；同時(shí)須配合適當(dāng)?shù)拿饺緞┮栽鰪?qiáng)它對組織的親和力，達(dá)到染色目的

伊紅（或曙紅）是人工合成的煤焦油類染料，紅色粉末狀，易溶于水或酒精，為酸性細(xì)胞胞質(zhì)染料；有伊紅Y、B、BN等，常用的是伊紅Y。伊紅常作為蘇木素的對比染色染料，染色中常需加助染劑和分化劑，使染色效果更加好

蘇木素（或蘇木精）是一種天然的染料，易溶于64二、蘇木素-伊紅染液的配制（一）蘇木素染液一種是將氧化劑（如氧化汞、高錳酸鉀、過氧化氫或碘酸鈉等）與媒染劑（硫酸鋁銨、硫酸鋁鉀或硫酸鋁鐵等）直接混合于蘇木素中配成溶液另一種是先用媒染劑媒染組織結(jié)構(gòu)，再用氧化的蘇木素（自然氧化）染色，最后用媒染劑分色

二、蘇木素-伊紅染液的配制（一）蘇木素染液65Harris蘇木素染液蘇木素1g無水酒精10ml硫酸鋁鉀（或硫酸鋁銨）20g蒸餾水200ml氧化汞0.5gHarris蘇木素染液66Mayer蘇木素液蘇木素1g蒸餾水1000ml碘酸鈉0.2g硫酸鋁鉀50g枸櫞酸鈉1g水合氯醛50gMayer蘇木素液67醇溶性伊紅染液伊紅Y0.5g95%酒精100ml水溶性伊紅染液伊紅Y0.5-1g蒸餾水75ml95%酒精25ml冰醋酸1~2滴（二）伊紅染液醇溶性伊紅染液（二）伊紅染液68（三）分化液去除過度染色或不需要著色的組織成份上顏色的過程，叫分色所使用的試劑配制的液體稱為分化液而蘇木素的分化過程中，使酸性條件轉(zhuǎn)變成堿性條件，蘇木素染色的結(jié)構(gòu)也由紅色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，所以這一過程又稱藍(lán)化

（三）分化液去除過度染色或不需要著色的組織成份上69

1．氫氧化銨水溶液（pH7.5-8.0）氫氧化銨（氨水）3ml蒸餾水1000ml2．1%鹽酸酒精溶液鹽酸1ml70%酒精99ml1．氫氧化銨水溶液（pH7.5-8.0）70三、石蠟切片染色中脫蠟、水洗、

脫水和透明等的作用

石蠟去石蠟去二甲苯水化顏色

二甲苯

酒精水染液透明

脫水水分二甲苯酒精三、石蠟切片染色中脫蠟、水洗、

脫水和透明等71四、染色程序

（一）脫蠟至水石蠟切片冰凍切片1．二甲苯（Ⅰ）5分鐘2．二甲苯（Ⅱ）5分鐘3．無水酒精（Ⅰ）5分鐘4．無水酒精（Ⅱ）5分鐘5．95%酒精5分鐘6．80%酒精1分鐘7．70%酒精1分鐘8．自來水2分鐘3分鐘9．蒸餾水1分鐘1分鐘四、染色程序（一）脫蠟至水72（二）染色石蠟切片冰凍切片1．蘇木素液5-15分鐘1-2分鐘2．自來水洗1分鐘30秒3．酸性分化液（鏡下控制）30秒20秒4．自來水藍(lán)化20分鐘20秒5．稀氨水30秒6.蒸餾水10秒20秒7．70%酒精3分鐘3分鐘8．80%酒精3分鐘3分鐘9．沉淀酸化伊