EMSA實驗方案翻譯

EMSA試驗試驗設(shè)計ControlSystemTestSystem10個，“#number”表示泳道序號。Table1.Controlreactionsfortheexpectedresults.ComponentFinalAmountControlReactions#1#2#3UltrapureWater----12μl11μl9μl10×BindingBuffer1×2μl2μl2μl50%Glycerol2.5%1μl1μl1μl100mMMgCl21μg/μlPoly(dI·dC)5mM50ng/μl1μl1μl1μl1μl1μl1μl1%NP-400.05%1μl1μl1μlUnlabeledEBNADNA4pmol--------2μlEBNAExtract1Unit----1μl1μlBiotin-EBNAControlDNA20fmol2μl2μl2μlTotalVolume----20μl20μl20μlTable2.BindingreactionsfortheTestSystem.ComponentFinalReactionsAmount#4#5#6#7 #8#9#10----5L1D5L6DW0 PPP0P3UltrapureWater----10×BindingBuffer1×2μl2μl2μl2μl 2μl2μl2μl1μg/μlPoly(dI·dC)50ng/μl1μl1μl1μl1μl 1μl1μl1μlOptional:50%Glycerol2.5%1μl1μl1μl1μl 1μl1μl1μlOptional:1%NP-400.05%1μl1μl1μl1μl 1μl1μl1μlOptional:1MKClOptional:100mMMgCl2Optional:200mMEDTA5mM1μl1μl1μl1μl 1μl1μl1μlUnlabeledTargetDNA4pmol----------------------------ProteinExtract2μg----BiotinEnd-LabeledTarget20fmolDNATotalVolume----20μl20μl20μl20μl20μl20μl20μl進(jìn)一步試驗UnlabeledTargetDNA(coldprobe)特異性競爭結(jié)合，排解非特異性結(jié)合的可能；最終在與探針結(jié)合的蛋白的位置凝膠切下測序。試驗預(yù)備試劑2020次，并過夜浸泡，使用過程避開穿插污染。500ml5TB〔0.22μm水系濾頭過濾：Trizma(Tris) 27gBoricacid 13.75g0.5mol/LEDTA-Na+(pH8.0)…10ml或直接加NaEDTA·2HO 1.86g2 2400ml500ml0.22μm水系濾器過濾；25ml40%Acrylamid〔丙烯酰胺甲雙叉丙烯酰胺：1﹕：Acrylamide 9.5gBIS 0.5g10ml20ml，0.45μm水系濾器過濾，于棕色瓶中4℃保存；顯影液和定影液：依據(jù)試劑說明配制，可用無特別處理的量筒配制，可重復(fù)使用3~4次；1ml10%AP〔過硫酸銨；不行使用過舊的〕:AP 0.1g去離子水 1ml4℃，2周內(nèi)有效；50ml5MNaCl：NaCl 14.61g去離子水 40ml50ml，高溫高壓滅菌，4℃保存；50ml0.5MEDTA(pH8.0)：NaEDTA·2HO 9.305g2 2去離子水 40ml+NaOH1g調(diào)整pH8.050ml，高溫高壓滅菌，室溫保存；50ml1MTris-HCl(pH7.5)：Trizma(Tris) 6.055g去離子水 40ml+3.5mlHCl，冷卻至室溫，調(diào)整pH7.550ml，高溫高壓滅菌，室溫保存；50%Glycero〔配膠用：Glycerol 1ml去離子水 1ml0.22μm水系濾器過濾；1%NP-40；TEMED；EBNAControlSystemcomponents；TestSystemsamples；UltrapureWater；設(shè)備儀器100m、500ml量筒；電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備〔包括冰袋和泡沫箱；大搖床；紫外超凈工作臺；10ml 小燒杯；6個大培育皿；尼龍膜；濾紙；水浴鍋；250ml錐形瓶1個；保鮮膜；暗盒；X-射線膠片；0.45μm和0.22μm濾頭；探針退火接頭退火流程：〔Oligo進(jìn)展退火連接，也可以選擇其他商業(yè)供給的高親和柱純化或HPLC〕A：為了建立接頭退火反響體系，需將以下成分混合：〔需依據(jù)Oligo針的量〕體系成分 終濃度OligonucleotideOligonucleotide1100nmol/mlOligonucleotide2 100nmol/ml1010×退火緩沖液*1×DEPC-Treatedwater 適量*10×退火緩沖液成分：100mMTris-HCl(pH7.5),10mMEDTA,1MNaClB：將oligo溶液放在65℃或者更高溫度下孵育10min〔保持恒定溫度和時間至關(guān)重要oligo溶液取出，并在室溫下緩慢冷卻〔1~2小時。C：將連接好的接頭于-20℃保存。試驗步驟PrepareandPre-RunGel制膠：按Table3試劑表制膠。Table3.6%Polyacrylamideminigel.Component Volume5×TBE(5×TBE(過濾)1ml40%Acrylamide 1.65ml50%50%Glycerol(過濾)0.5mlTEMED 10μlUltrapureUltrapureWater6.78ml10min10%10%AP60μlTotalVolume 10ml30min0.5×TBE電泳緩沖液。預(yù)電泳：0.5×TBE5min，觀看無漏，則連續(xù)加緩沖液至沒過金屬線；100V，13~15mA預(yù)電泳〔可直接調(diào)整電流，不調(diào)電壓〕至電流恒定，30~60min。同0.5×TBE4℃冰箱預(yù)冷，為電轉(zhuǎn)運作預(yù)備。PrepareandPerformBindingReactions①冰上解凍EBNAControlSystemcomponentsTestSystemsamples〔不要渦旋和用手捂熱，使用時再室溫解凍EBNAExtrac。②依據(jù)Table1Table220μl20min。5μl5×LoadingBuffer20μl反響體系，上下吹打數(shù)次，充分搖勻，不要旋渦或猛烈混勻。ElectrophoreseBindingReactions20μl到膠孔中，翻開電流〔設(shè)定為100V為8×8×0.1厘米凝膠〕，2/33/46％凝膠中游離的biotin-EBNAControlDNAduplex位于溴酚藍(lán)遷移后面。ElectrophoreticTransferofBindingReactionstoNylonMembrane①0.5×TBE10min。②依據(jù)“〔底〕海綿+2層+凝膠+尼龍膜+2層+海綿”將膜等放在一個干凈的電泳轉(zhuǎn)移槽中〔避開使用已被用于免疫印跡海綿，加0.5TBE電泳緩沖液至沒過海綿。③380mA〔~100V〕45~60min，轉(zhuǎn)運過程預(yù)備交聯(lián)設(shè)備，并將BlockingBuffer和4×WashingBuffer50℃水浴至全部顆粒溶解。④完成后，將膜的溴酚藍(lán)一側(cè)〔與凝膠相貼一面，即正面〕朝上放置于干紙巾上。在凝膠中不應(yīng)有任何殘留的染料〕不要讓膜枯燥，馬上進(jìn)展下一步。Cross-linkTransferredDNAtoMembrane10cm10min。DetectBiotin-labeledDNAbyChemiluminescence①BlockingBuffer4×WashingBuffer50℃之間使用，保持全部的顆粒留在溶液中。SubstrateEquilibrationBuffer4℃和室溫使用之間。②封閉膜：〔以下操作均保持膜正面朝上20mlBlockingBuffer45rpm15min。③預(yù)備conjugate/blockingsolution：20mlBlockingBuffer中參與66.7μlStabilizedStreptavidin-HorseradishPeroxidaseConjugate〔1:300稀釋。④倒出膜中的BlockingBufferconjugate/blockingsolution。45rpm15分鐘；1×washsolution：40ml4×WashBuffer+120mlultrapurewater。⑤膜轉(zhuǎn)移到一個培育皿，用20ml1×washsolution洗，45rpm5min，共洗膜4次。30mlSubstrateEquilibrationBuffer，45rpm5分鐘；關(guān)燈：預(yù)備SubstrateWorkingSolution：6mlLuminol/EnhancerSolution+6mlStablePeroxideSolution。暴露在陽光下或任何強光都會破壞WorkingSolution，應(yīng)保存在棕色瓶并避開長時間暴露在強光下；短期暴露于通常的試驗室燈光不會破壞溶液。⑦將膜從SubstrateEquilibrationBuffer中取出，用紙巾留神地吸