高中生物選修1專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件

課題1DNA的粗提取與鑒定一.基礎(chǔ)知識(shí)DNA粗提取的基本思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。1.提取生物大分子的基本思路：選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。課題1DNA的粗提取與鑒定一.基礎(chǔ)知識(shí)DNA粗提取的基本思12.DNA的理化特性1)DNA的溶解性在NaCl溶液濃度在0.14mol/L時(shí),DNA溶解度最??；低于(或高于)0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的降低(或增加)而逐漸增大。DNA的不溶于酒精，某些蛋白質(zhì)溶于酒精2.DNA的理化特性1)DNA的溶解性在NaCl溶液濃度在022)DNA的其它特性①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒有影響②大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60－80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性③洗滌劑可以瓦解細(xì)胞的細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒有影響3.DNA的鑒定原理1)DNA＋二苯胺試劑沸水浴溶液變藍(lán)色2)DNA可被甲基綠染成綠色2)DNA的其它特性①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒有影3一)實(shí)驗(yàn)原理二.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.破碎細(xì)胞，釋放核物質(zhì)動(dòng)物細(xì)胞加蒸餾水讓細(xì)胞吸水脹破,過濾得濾液植物細(xì)胞加洗滌劑和食鹽,充分研磨蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是低滲溶液,水分可大量進(jìn)入雞血細(xì)胞,是細(xì)胞脹裂,從而釋放DNA攪拌可加速細(xì)胞破裂討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？一)實(shí)驗(yàn)原理二.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.破碎細(xì)胞，釋放核物質(zhì)動(dòng)物細(xì)胞加蒸4二)實(shí)驗(yàn)材料的選取選DNA含量較高的生物組織作為材料,成功可能性更大材料：可選魚卵、豬肝、雞血2.除去雜質(zhì)，分離出DNA用濃度為2mol/L的NaCl溶液溶解DNA,逐漸加水稀釋,當(dāng)降至0.14mol／L時(shí)(溶解度最低)可以使DNA析出向DNA的鹽溶液，逐漸加酒精，可析出DNA二)實(shí)驗(yàn)材料的選取選DNA含量較高的生物組織作為材料,成功可5三)實(shí)驗(yàn)步驟1.0.1g/ml的檸檬酸鈉溶液,按1:2的比例與新鮮雞血混合攪拌均勻，將血液置于冰箱中24小時(shí),棄上部澄清液雞血加入檸檬酸鈉溶液液，是為了防止血液凝固。三)實(shí)驗(yàn)步驟1.0.1g/ml的檸檬酸鈉溶液,按1:2的比6三)實(shí)驗(yàn)步驟2.取燒杯中的血細(xì)胞液約5~10ml加入到100ml燒杯中，向燒杯中加入20ml蒸餾水，用玻棒沿一個(gè)方向快速攪拌5分鐘，加速血細(xì)胞在低滲溶液中的破裂3.將2mol/L的氯化鈉溶液50ml緩緩倒入燒杯中，用玻棒沿一個(gè)方向攪拌，使DNA溶解于氯化鈉溶液中，過濾取濾液三)實(shí)驗(yàn)步驟2.取燒杯中的血細(xì)胞液約5~10ml加入到107三)實(shí)驗(yàn)步驟4.將雞血細(xì)胞DNA提取液置于較大的燒杯中，沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩倒入蒸餾水，并不斷攪拌，直到粘稠狀DNA不再析出為止。用玻棒攪拌，使析出的DNA纏繞于玻棒末端。5.將析出的DNA再溶解于2mol/L的氯化鈉溶液中。6.在DNA的氯化鈉溶液中倒入95%的酒精50ml（冷卻過的酒精效果較好)，使DNA再次析出，用玻棒攪拌，使DNA再次纏繞于玻棒末端。2mol/LNaCl溶液冷酒精三)實(shí)驗(yàn)步驟4.將雞血細(xì)胞DNA提取液置于較大的燒杯中，沿8三)實(shí)驗(yàn)步驟7.DNA的鑒定：取兩支試管，各加入2ml0.015氯化鈉溶液，將DNA溶解于其中一支試管中，另一支做為對(duì)照組。然后，在兩支試管內(nèi)加等量的二苯胺試劑，水浴加熱10min左右，冷卻，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。三)實(shí)驗(yàn)步驟7.DNA的鑒定：取兩支試管，各加入2ml0.9例1.下列關(guān)于DNA的敘述正確的是(）A.隨著氯化鈉溶液濃度增大，DNA在氯化鈉溶液中的溶解度也增大B.隨著氯化鈉溶液濃度的減小，DNA在氯化鈉溶液中的溶解度也減小C.DNA不溶于酒精，也不溶于0.14mol/L的氯化鈉溶液D.DNA與二苯胺試劑在沸水中加熱，溶液變藍(lán)色D例1.下列關(guān)于DNA的敘述正確的是(）D10例2.雞血中含大量紅細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)室常用雞血提取DNA。根據(jù)DNA提取實(shí)驗(yàn)，完成下列各題。1.為了防止雞血凝血需加入的試劑是。2.將雞血離心，取下層，除去上清的目的是3.向DNA的氯化鈉溶液緩緩加蒸餾水，直至析出DNA不再增加，此時(shí)氯化鈉溶液的濃度約為

.檸檬酸鈉去雜質(zhì)0.14mol/L4.若沒雞血，能否用牛羊血代替？為什么？5.若用菜花進(jìn)行提取,需加入,并充分研磨洗滌劑和食鹽例2.雞血中含大量紅細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)室常用雞血提取DNA。根據(jù)DN11課題2

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段

（PCR）課題2

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段

（PCR）12一、基礎(chǔ)知識(shí)一)PCR原理PCR是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。1.PCR的反應(yīng)條件一定的緩沖溶液--維持pH；DNA模板；分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；四種脫氧核苷酸；耐熱的DNA聚合酶；控制溫度一、基礎(chǔ)知識(shí)一)PCR原理PCR是一種在體外快速擴(kuò)增13因此，DNA復(fù)制方向：只能從子鏈的5’端到3’端延伸2.DNA復(fù)制的方向DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能將核苷酸連接到DNA片段的3’端。引物能與母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的一小段單鏈DNA片段或RNA且需要引物(20～30個(gè)核苷酸)因此，DNA復(fù)制方向：只能從子鏈的5’端到3’端延伸2.DN14PCR技術(shù)通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合DNA在80～100℃時(shí)雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體,雙鏈分開;當(dāng)溫度降低后雙鏈又能重新結(jié)合成雙螺旋結(jié)構(gòu)因此,PCR過程無(wú)需解旋酶,但需耐高溫的DNA聚合酶3.DNA的熱變性原理PCR技術(shù)通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合DNA在15二)PCR的反應(yīng)過程1.變性：2.復(fù)性：3.延伸：循環(huán)升高溫度到900C以上DNA解聚為單鏈溫度降到500C左右兩種引物與兩條單鏈DNA結(jié)合升溫度升到700C左右在DNA聚合酶的作用下用溶液中的脫氧核苷酸根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新DNA鏈二)PCR的反應(yīng)過程1.變性：2.復(fù)性：3.延伸：循環(huán)升高溫16一)實(shí)驗(yàn)操作步驟準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方用微量移液器按配方在往微量離心管中加入各組分蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應(yīng)液離心10S將離心管放入PCR儀上,設(shè)置好循環(huán)程序進(jìn)行反應(yīng)二、實(shí)驗(yàn)操作一)實(shí)驗(yàn)操作步驟準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方用微量移液器按配方17二)操作提示PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；②所用試劑在-20℃保存，使用時(shí)，放在冰塊上慢慢融化。③分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭。二)操作提示PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污18三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)---DNA含量的測(cè)定1、測(cè)定的原理可以通過計(jì)算DNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2、過程①稀釋：2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋。②對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值③比色三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)---DNA含量的測(cè)定1、測(cè)定的原理19④計(jì)算DNA含量(g/mL)＝50x(260nm的讀數(shù))x稀釋倍數(shù)50：1g/mL的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02④計(jì)算DNA含量(g/mL)＝50x(260nm的讀數(shù))x20課題3血紅蛋白的提取和分離課題3血紅蛋白的提取和分離21課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識(shí)一)凝膠色譜法根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，來進(jìn)行分離。1.概念：思路利用不同蛋白質(zhì)分子的特性(形狀、大小、帶電情況等)差異，分離不同種類的蛋白質(zhì)課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識(shí)一)凝膠色譜法根22課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識(shí)一)凝膠色譜法2.原理：2）①當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢;②而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。1)凝膠是由多糖類化合物(如葡聚糖)構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識(shí)一)凝膠色譜法2.原理：23課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識(shí)二)緩沖液1.概念:在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識(shí)二)緩沖液1.概念:24課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離步驟：1.樣品處理2.粗分離3.純化4.純度鑒定課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離步25課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理:1)紅細(xì)胞的洗滌:目的:去除雜蛋白b低速短時(shí)間離心操作:a采集血樣d鹽水洗滌c吸取血漿上層透明的黃色血漿重復(fù)bcd步驟三次用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的NaCl溶液洗滌加抗凝劑－－檸檬酸鈉課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理:1)紅細(xì)26課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理:2)血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積,再加40％體積的甲苯,置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘(加速細(xì)胞破裂)細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。3)分離血紅蛋白溶液：課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理:2)血紅27課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理:3)分離血紅蛋白溶液：過程：離心(以2000r/min,10min)過濾(用濾紙,除去脂溶性沉淀層)分離(用分液漏斗,分出下層的紅色透明液體)課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作1.樣品處理:3)分離28課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作2.粗分離－－透析③過程：①透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)②原理：利用透析袋的半透性某些雜質(zhì)分子比血紅蛋白分子小，可透過透析袋課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作2.粗分離－－透析③過程29課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作3.純化1)凝膠色譜柱的制作：①玻璃管②底塞的制作③頂塞的制作④組裝⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)原理用凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去步驟課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作3.純化1)凝膠色譜柱30課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作3.純化步驟2)凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇②凝膠的前處理③凝膠色譜柱的裝填方法注意:a凝膠裝填時(shí)盡量緊密,以降低凝膠顆粒之間的空隙b裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作3.純化步驟2)凝膠色31課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作3.純化步驟2)凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇②凝膠的前處理③凝膠色譜柱的裝填方法注意:a凝膠裝填時(shí)盡量緊密,以降低凝膠顆粒之間的空隙b裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在④洗滌平衡注意：a液面不要低于凝膠表面，b不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作3.純化步驟2)凝膠色323.樣品的加入和洗脫

1.調(diào)液面2.加樣3.再調(diào)液面

4.洗脫5.收集緩沖液凝膠3.樣品的加入和洗脫1.調(diào)液面2.加樣33課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作3.純化步驟3)樣品加入與洗脫

注意：a不要觸及并破壞凝膠面。b貼壁加樣。c使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作3.純化步驟3)樣品加34課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作4.純度鑒定SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳2.試劑的配制：鑒定血紅蛋白純度。1.目的：3.電泳方法步驟略課題3血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)操作4.純度鑒定SDS—聚35課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識(shí)三)電泳1.概念:帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程2.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識(shí)三)電泳1.概念:帶電36課題3血紅蛋白的提取和分離SDS--聚丙稀酰胺凝膠電泳法SDS十二烷基硫酸鈉作用:能使蛋白質(zhì)變性(解聚);