新冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)課件

人冠狀病毒病原學(xué)與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人冠狀病毒病原學(xué)與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)冠狀病毒（coronavirus)概述：1933年，Baudette等描述了雞的“哮喘病”，1937年首次從小雞體內(nèi)分離出冠狀病毒，分離的病毒被鑒定為傳染性支氣管炎病毒(Infectiousbronchitis,IBV);1951年，Gledhill等分離出鼠肝炎病毒(Murinehepatitisvirus,MHV)；1965年，Tyrrell和Bynoe首次在體外用人胎鼻和氣管培養(yǎng)方法，從普通感冒病人鼻洗液中分離出一株病毒，命名為B814病毒。冠狀病毒（coronavirus)1966年，Hamre和Procknow用人胚腎細(xì)胞分離到類似病毒，代表株命名為229E病毒。

1967年，Mclntosh等用人胚氣管培養(yǎng)從感冒病人中分離到一批病毒，其代表株是OC43（OC代表organculture）。隨后證明，OC和229E病毒。1968年，JuneAlmeida和Tyrrell對(duì)這些病毒進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這些病毒的包膜上有形狀類似日冕的棘突，故提出命名這類病毒為冠狀病毒。1975年，國(guó)際病毒命名委員會(huì)（InternationalCommitteeontheTaxonomyofViruses,ICTV）正式命名了冠狀病毒科（coronaviride)致病性：人冠狀病毒常引起1)普通感冒、是輕型感染。2)腹瀉或胃腸炎。3）下呼吸道感染或肺炎1966年，Hamre和Procknow用人胚腎細(xì)胞分離X1X2X3X4X5NME20,00130,0000.51.01.52.02.53.04.05.06.09.025,000SRNA6123kBRNA5RNA4RNA3RNA28.3kb4.5kb3.4kb2.5kb1.7kbSORF1bORF1aNMEABC15,00010,00015,00020,00025,00030,000HCoV基因組與mRNAHCoVs為最大單股正鏈RNA病毒，獨(dú)特的胞漿內(nèi)非連續(xù)性轉(zhuǎn)錄模式，易于發(fā)生基因組的變異與重組SARS-CoVX1X2X3X4X5NME20,00130,0000.51.中國(guó)大陸全中國(guó)全世界發(fā)病5327發(fā)病7429發(fā)病8096死亡349死亡685死亡774涉及世界29個(gè)國(guó)家和地區(qū)2002年冬－2003年春始發(fā)于我國(guó)廣東，而后蔓延至我國(guó)大部分省市，并波及世界29個(gè)國(guó)家和地區(qū)。2003年4月16日，世界衛(wèi)生組織宣布，嚴(yán)重急性呼吸綜合癥是由一種從未引起人類疾病的新型冠狀病毒所致，這種新的病毒被命名為SARS-Coronavirus(SARS-CoV)SARS

(severeacuterespiratorysyndrome)嚴(yán)重急性呼吸綜合征－21世紀(jì)新出現(xiàn)的傳染病中國(guó)大陸全中國(guó)全

在SARS-CoV發(fā)現(xiàn)后，又有三種新的引起呼吸系統(tǒng)疾病的HCoV（HCoV-NL63，HCoV-HKU1與HCoV-2012）被相繼發(fā)現(xiàn)，引起人類呼吸道疾病的HCoV（包括SARS-CoV）已有6種，急需研發(fā)這類疾病診斷和鑒別診斷的新技術(shù)。繼SARS-CoV后,新HCoV病原的發(fā)現(xiàn)HCoV-2012在SARS-CoV發(fā)現(xiàn)后，又有三種新的引起冠狀病毒NL63

vanderHoeketal.,2004.Nat.Med.10:368-373最初從一名七月齡的，因發(fā)燒、細(xì)支氣管炎和結(jié)膜炎入院的患兒中分離。在Hela和TMK細(xì)胞中檢測(cè)到細(xì)胞毒效應(yīng)CPE。隨機(jī)擴(kuò)增，分離出特異性片段，經(jīng)測(cè)序證明是一種新的呼吸道病毒。NL63的特異性RT-PCR檢測(cè)兒童的NPA為陽(yáng)性?；仡櫺缘姆治鰪?002年12月到2003年2月中測(cè)序的呼吸道樣本中，有7例陽(yáng)性標(biāo)本。其中五個(gè)患兒是4-6月齡，兩個(gè)患者,分別是40歲和67歲。冠狀病毒NL63

vanderHoeketal.冠狀病毒HKU1

Wooetal.,2005.J.Virol.79:884-895從一名71歲的患有肺炎的老人中分離出來(lái)。該患者吸煙，并患有慢性阻塞性肺病。臨床癥狀：發(fā)燒，咳嗽，膿性痰，胸肺X光片顯示有斑點(diǎn)浸潤(rùn)。常規(guī)病毒學(xué)檢測(cè)呈陰性。RT-PCR確定是一種新的冠狀病毒?；仡櫺院Y選400份NPA樣本，有一例是陽(yáng)性，患者是一名35歲的婦女，患有肺炎。定量RT-PCR：1.1x106copies/mL冠狀病毒HKU1

Wooetal.,2005.新冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)課件新冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)課件北京兒童醫(yī)院重癥下呼吸道·感染·嬰幼兒呼吸道病毒的檢測(cè)2008-2010年，采集住院病人鼻咽拭子370份，應(yīng)用xTAG?

RVPPanel試劑盒進(jìn)行多種呼吸道病毒檢測(cè)。樣品檢出陽(yáng)性率：96.22%檢測(cè)結(jié)果表明，感染率較高的病毒分別為：Piconavirus：54.05%RSVB：46.49%Bocavirus：33.78%PIV3:15.41%Adenovirus：12.97%HMPV：8.65%IFVA：7.03%HCoVs：6.76%xTAG?RespiratoryViralPanelVersion1(RVP呼吸道病毒檢測(cè)試劑盒)產(chǎn)品基于Luminex開(kāi)放式結(jié)構(gòu)平臺(tái)，將xTAG?技術(shù)與xMAP?技術(shù)有效融為一體，可快速準(zhǔn)確檢測(cè)多種呼吸道病毒。已或美國(guó)FDA批準(zhǔn)臨床應(yīng)用北京兒童醫(yī)院重癥下呼吸道·感染·嬰幼兒呼吸道病毒的檢測(cè)200發(fā)熱呼吸道癥候群病原譜構(gòu)成及其流行規(guī)律病原譜年齡分布發(fā)熱呼吸道癥候群病毒病原原譜的時(shí)間趨勢(shì)發(fā)熱呼吸道癥候群病原譜構(gòu)成及其流行規(guī)律病原譜年齡分布發(fā)熱呼吸2012中東出現(xiàn)的新型冠狀病毒近日，一名曾前往沙特旅游的卡塔爾男子被確認(rèn)感染了一種新型冠狀病毒，也一度被媒體稱為類似SARS病毒。目前這名男子正在英國(guó)接受治療，生命垂危。其肺部組織提取的病毒與此前沙特曾出現(xiàn)的一個(gè)死亡病例相比，基因排序相似度為99.5%。兩人的臨床表現(xiàn)都是急性重癥呼吸道感染合并急性腎衰竭。目前在全球只確認(rèn)了這兩個(gè)病例。還沒(méi)有證據(jù)表明該病毒能夠在人與人之間進(jìn)行傳播。新的冠狀病毒和引起非典(嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征)的冠狀病毒不同。2012中東出現(xiàn)的新型冠狀病毒近日，一名曾前往沙特旅游的卡塔Fig.Phylogeneticanalysisbasedon1ageneofcoronavirusesandthenewnovelcoronavirus基于已知序列的系統(tǒng)發(fā)生分析213Fig.PhylogeneticanalysisbasLondon1與Bat-CoV-HKU5序列比對(duì)比對(duì)結(jié)果顯示，London1與HKU5的相似性83.2%London1與Bat-CoV-HKU5序列比對(duì)比對(duì)結(jié)果顯示London1與Bat-CoV-HKU4序列比對(duì)比對(duì)結(jié)果顯示，London1與HKU4的相似性82.7%London1與Bat-CoV-HKU4序列比對(duì)比對(duì)結(jié)果顯示Examplesofbatsandbirdsfromwhichnovelcoronaviruseswerediscovered.Chinesehorseshoebat(Rhinolophussinicus)(panelA),fromwhichbat-SARS-CoVandbat-CoVHKU2werediscovered;Lesserbamboobat(Tylonycterispachypus)(panelB),fromwhichbat-CoVHKU4wasdiscovered;Leschenault’srousette(Rousettuslechenaulti)(panelC),fromwhichbat-CoVHKU9wasdiscovered;ExamplesofbatsandbirdsfroAmodelofcoronavirusevolutionCoVsinbatsarethehypothesizedgenepoolofgroup1andgroup2CoVsandCoVsinbirdsarethehypothesizedgenepoolofgroup3CoVs.Amodelofcoronavirusevoluti急性呼吸道感染診斷臨床診斷非特異性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)X-光檢測(cè)特異性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)呼吸道及血清樣本用來(lái):抗原檢測(cè)病毒分離核酸擴(kuò)增急性呼吸道感染診斷臨床診斷病毒分離:金標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測(cè):迅速，敏感血清學(xué)抗體檢測(cè)：IgM檢測(cè);IgG檢測(cè):需要兩個(gè)樣本中和試驗(yàn)核酸檢測(cè)：

快速敏感病毒診斷學(xué)病毒分離:金標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)抗體檢測(cè)：IgM檢測(cè);病毒診斷學(xué)

潛伏期

1-12

天,平均5-6

天,潛伏期內(nèi)無(wú)傳染性,發(fā)病即有傳染性

若將一個(gè)傳染周期定在5-6

天(平均潛伏期),發(fā)病5

天內(nèi)能確診病人,則可能將疫情有效控制在2

代病人以內(nèi)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)在SARS診斷中的重要作用BSL-3實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)在SARS診斷中的重要作用BSL-3

1．SARS診斷分類與標(biāo)準(zhǔn)（1）疑似病例：對(duì)于缺乏明確流行病學(xué)依據(jù)，但具備其它SARS支持證據(jù)者，如臨床表現(xiàn)和肺X線變化等，可以作為疑似病例，需進(jìn)一步進(jìn)行流行病學(xué)追訪，并安排病原及血清學(xué)檢查以求印證。對(duì)于有流行病學(xué)依據(jù)，有臨床癥狀，但尚無(wú)肺部X線影像學(xué)變化者，也應(yīng)作為疑似病例。（2）臨床診斷病例：對(duì)于有SARS流行病學(xué)依據(jù)、相應(yīng)臨床表現(xiàn)和肺部X線影像改變，并能排除其他疾病診斷者，可以作出SARS臨床診斷。（3）確定診斷：在疑似和臨床診斷的基礎(chǔ)上，若分泌物或血清SARS-CoVRNA檢測(cè)陽(yáng)性，或血清（或血漿）SARS-CoV特異性N蛋白抗原檢測(cè)陽(yáng)性，或血清SARS-CoV抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，或抗體滴度4倍及以上增高，則可做出確定診斷。SARS的診斷標(biāo)準(zhǔn)1．SARS診斷分類與標(biāo)準(zhǔn)SARS的診斷標(biāo)準(zhǔn)呼吸道樣本拭子或抽吸物鼻咽拭子氣管、支氣管深部灌洗，肺泡灌洗液樣本轉(zhuǎn)移液呼吸道樣本拭子或抽吸物SARS實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法一覽表SARS實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法一覽表SARS網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)內(nèi)容與方法建議診斷時(shí)期內(nèi)容方法標(biāo)本

早期診斷血清Ｎ抗原ELISA,PCR血清，鼻咽拭子發(fā)病5天以內(nèi)病毒核酸中期診斷病毒核酸PCR,ELISA

血清，鼻咽拭子發(fā)病10天以內(nèi)血清Ｎ抗原IFA,NT

糞便，肛拭，尿

IgM,IgG&NAb

晚期診斷IgM,IgG&NAb

ELISA,

NT血清，鼻咽拭子發(fā)病10天以上病毒核酸

PCR,IFA糞便，肛拭，尿血清Ｎ抗原

建議對(duì)不明原因重癥肺炎常規(guī)進(jìn)行血清SARS-CoVN蛋白檢測(cè)

SARS網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)內(nèi)容與方法建議診斷時(shí)期HCoV（2012）

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)近期曾往中東地區(qū)，出現(xiàn)上呼吸道感染后，如果癥狀加重，或呼吸困難，建議立刻就診并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。WHO發(fā)布了臨時(shí)病例定義來(lái)幫助各國(guó)加強(qiáng)針對(duì)這種新病毒的健康保護(hù)措施?；谀壳鞍l(fā)現(xiàn)的病例，分為“正在調(diào)查中的病人”、“可能病例”和“確診病例”。病例的分類基于臨床、流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)。目前可進(jìn)行分子檢測(cè)（PCR與熒光定量PCR）HCoV（2012）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)近期曾往中東地區(qū)，出現(xiàn)上呼吸London1_novel_CoV_2012_nsp12(partial)TATTAGTGCTAAGAATAGAGCTCGCACTGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGCACAATGACTAATCGCCAGTACCATCAGAAAATGCTTAAGTCCATGGCTGCAACTCGTGGAGCGACTTGCGTCATTGGTACTACAAAGTTCTATGGTGGCTGGGATTTCATGCTTAAAACATTGTACAAAGATGTTGATAATCCGCATCTTATGGGT(208nt)partialnucleotidesequenceoftheviralpolymerase(nsp12)London1_novel_CoV_2012_nsp12(p系統(tǒng)發(fā)生分析HPA公布的結(jié)果，2012-9-25系統(tǒng)發(fā)生分析HPA公布的結(jié)果，2012-9-25GenBankBLAST比對(duì)結(jié)果1.GenBankBLAST比對(duì)結(jié)果1.2.London1_novel_CoV_2012_nsp12核苷酸序列與與SARS-CoV-Tor2株相應(yīng)區(qū)段同源性為73.6%2.London1_novel_CoV_2012_nsp12引物設(shè)計(jì)與應(yīng)用基于上述引物探針，我們已建立常規(guī)PCR方法（F-1,R-1；PCR片段201bp)，半套式PCR方法(1stPCR:F-1,R-1;nestedPCR:F-1,R-2；PCR片段127bp)兩種熒光定量PCR方法（F-1,R-2，TZ1；或F-2,R-2，TZ2)與其他人冠狀病毒無(wú)交叉反應(yīng)；可初步用于新型冠狀病毒（2012）的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)與應(yīng)用基于上述引物探針，我們已建立常規(guī)PCR方法（F引物設(shè)計(jì)與應(yīng)用2基于對(duì)London-1NovelCoronavirus已知序列與Bat-CoV-HKU多株序列比對(duì)，我們分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)針對(duì)HKU4和HKU5的引物及其套式引物，可分別用于Bat-CoV-HKU4和HKU5核酸特異性檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)與應(yīng)用2基于對(duì)London-1NovelCoro巢式PCR普通PCRPCR產(chǎn)物電泳或測(cè)序逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA核酸提取

熒光定量PCR

鼻咽拭子標(biāo)本PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方案巢式PCR普通PCRPCR產(chǎn)物電泳或測(cè)序逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA核酸(基因)檢測(cè)基因擴(kuò)增(PCR)

靶序列模板DNA35個(gè)循環(huán)340億拷貝標(biāo)本中存在病毒核酸，但不一定存在活病毒可以確定存在感染PCR產(chǎn)物可以測(cè)定核苷酸序列，確定病原需要較好的經(jīng)驗(yàn)核酸(基因)檢測(cè)基因擴(kuò)增(PCR)靶序列模板DNA35個(gè)循冠狀病毒檢測(cè)通用引物對(duì):

Cor-FW(5'-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3')

Cor-RV(5'-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3‘)冠狀病毒通用引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳One-stepRT-PCRassays(OneStepRT-PCRkit;QIAGEN)a50μlreactionvolumecontaining10μLRNA-extract,10μl5xQIAGENOneStepRT-PCRBuffer,2μldNTPmix(finalconcentrationof400μMofeachdNTP),1.8μlQIAGENOneStepRT-PCREnzymeMix(acombinationofOmniscriptandSensiscriptreversetranscriptaseandHot-StarTaqDNApolymerase),4μMofeachprimer,andRNase-freewaterto50μl.Thereactionwascarriedoutwithaninitialreversetranscriptionstepat50°Cfor30min,followedbyPCRactivationat95°Cfor15min,50cyclesofamplification(30secat94°C;30secat48°C;1minat72°C),andafinalextensionstepat72°Cfor10min冠狀病毒檢測(cè)通用引物對(duì):

Cor-FW(5'-ACWCA定量PCR，TaqMan體系A(chǔ)BI公司首先推出(PRISM7000系列)。實(shí)時(shí)檢測(cè):

每個(gè)循環(huán)都會(huì)