蜜蜂體內(nèi)p450的活性及對(duì)農(nóng)藥毒性的反應(yīng)

蜜蜂體內(nèi)p450的活性及對(duì)農(nóng)藥毒性的反應(yīng)

1真菌毒素檢測(cè)喂食花粉、花蜜和蜂膠時(shí)，蜜蜂不可避免地會(huì)吸收一些植物產(chǎn)生的生物化學(xué)材料，并發(fā)現(xiàn)真菌毒素。在采集的過(guò)程中也會(huì)接觸一些農(nóng)藥,尤其是一些殺螨藥劑。蜜蜂通過(guò)體內(nèi)的解毒酶對(duì)這些外源性物質(zhì)進(jìn)行初級(jí)分解,然而,截至目前需要大量研究來(lái)了解蜜蜂體內(nèi)解毒酶的作用機(jī)理。2利用其他昆蟲中的p450采用多種方法確定食物中的毒素對(duì)蜜蜂敏感性的影響,特別是蜜蜂對(duì)一些人工合成和天然外源性物質(zhì)的敏感性,包括對(duì)殺螨劑氟胺氰菊酯、吡蟲啉和黃曲霉毒素等的敏感性。通過(guò)研究了昆蟲體內(nèi)p450的潛在誘導(dǎo)物和第一階段解毒的主要生化體系,明確如何調(diào)節(jié)解毒。在一些昆蟲中,苯巴比妥可以誘導(dǎo)p450的表達(dá),氟胺氰菊酯主要由p450酶降解,飼喂苯巴比妥后,氟胺氰菊酯對(duì)蜜蜂的毒性沒(méi)有受到影響。與蜜蜂對(duì)氟胺氰菊酯的耐受性類似,給蜜蜂飼喂花椒毒素、水楊酸和吲哚乙酸后,也沒(méi)有誘導(dǎo)蜜蜂的p450,雖然飼喂花椒毒素、水楊酸和吲哚乙酸可以誘導(dǎo)其他昆蟲體內(nèi)的p450表達(dá)。只有蜂蜜和花粉中含有的槲皮素可以誘導(dǎo)p450,降低氟胺氰菊酯的毒性。利用微陣列芯片技術(shù),未發(fā)現(xiàn)飼喂過(guò)苯巴比妥的蜜蜂中腸中解毒酶基因表達(dá)發(fā)生變化,northern雜交分析表明在飼喂過(guò)蜂蜜、蜂花粉和蜂膠提取物的蜜蜂中腸內(nèi)檢測(cè)到3種p450CYP6AS基因的過(guò)量表達(dá)。生物測(cè)定中,蜜蜂食物并沒(méi)有改變氟胺氰菊酯和吡蟲啉的毒性,但與飼喂蜂蜜的蜜蜂相比,黃曲霉毒素對(duì)飼喂蔗糖或者高果糖漿的蜜蜂毒性更大。3蜜蜂對(duì)p450酶的誘導(dǎo)效應(yīng)這些結(jié)果表明,蜜蜂體內(nèi)p450s主要由蜂巢周圍的自然物質(zhì)調(diào)節(jié),從毒理學(xué)上分析,蔗糖的飼喂效果無(wú)法與蜂蜜的效果相比擬。意大利蜜蜂是美國(guó)第一個(gè)人工控制的授粉者,它為超過(guò)90%的植物授粉,每年創(chuàng)造的經(jīng)濟(jì)價(jià)值超過(guò)140億美元。由于一些環(huán)境中有毒物質(zhì)的存在影響了蜜蜂的生命活動(dòng),進(jìn)而影響整個(gè)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。蜜蜂在采集的過(guò)程中,很容易接觸到大量的農(nóng)藥。幾十年來(lái),大量的農(nóng)藥用來(lái)防治農(nóng)業(yè)害蟲和疾病防治,同時(shí)也造成蜜蜂的死亡和病變。盡管已經(jīng)開(kāi)始限制或者減少在農(nóng)田和森林中使用農(nóng)藥,但是農(nóng)藥的繼續(xù)使用仍造成非靶標(biāo)生物蜜蜂的死亡。亞致死劑量的農(nóng)藥被認(rèn)為是可以降低蜜蜂的生存能力,而且最近20a,一種具有毀滅性的寄生蟲大蜂螨的存在,導(dǎo)致蜂巢內(nèi)大量使用殺螨劑,進(jìn)而給蜜蜂形成了更大的環(huán)境毒力壓力,使得蜜蜂在整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)都接觸農(nóng)藥,而大家仍未可知蜜蜂是怎么處理和承受這些有毒物質(zhì)。與其他的昆蟲一樣,蜜蜂在一定程度上依賴其體內(nèi)一系列的解毒酶來(lái)分解這些自然中有毒物質(zhì)和農(nóng)藥。這一系列解毒酶中最重要的就是p450酶,p450酶在降解這些蜜蜂取食的花粉和花蜜中的植物化學(xué)物質(zhì)發(fā)揮著作用。另外,蜂巢中貯存的大量花粉和食物為真菌和曲霉菌提供了適宜的環(huán)境,他們所產(chǎn)生的真菌毒素也可以被蜜蜂體內(nèi)的p450s所降解。人工合成的殺蟲劑也可以被蜜蜂體內(nèi)的p450s所代謝。氟胺氰菊酯是一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,在蜂業(yè)生產(chǎn)中被用于防治大蜂螨,也可以被p450s所代謝。擬除蟲菊酯類的高效氯氟氰菊酯和有機(jī)磷酸酯類的毒死蜱也可以被p450s所代謝。事實(shí)上,蜜蜂對(duì)于這些殺螨劑具有耐藥性主要得益于蜜蜂體內(nèi)p450s的快速降解作用,這也是蜂農(nóng)在蜂群中安全使用這些殺螨劑來(lái)防治大蜂螨的原因。盡管農(nóng)藥的毒性隨著種類的不同而不同,但是大多數(shù)的有機(jī)磷酸酯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)蜜蜂是高毒性的。蜜蜂對(duì)農(nóng)藥的敏感性研究已經(jīng)轉(zhuǎn)移到對(duì)蜜蜂基因組測(cè)序的討論。在許多害蟲中,p450s是主要參與抗藥性和耐藥性的酶,但是,在西方蜜蜂基因組中只46個(gè)編碼p450s基因,遠(yuǎn)低于其他昆蟲的基因組。而且蜜蜂體內(nèi)的羧酸酯酶和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶家族以及其他需氧生物體內(nèi)的其他解毒酶都相對(duì)較少。研究表明,這些解毒酶種類的減少增加了蜜蜂對(duì)特定農(nóng)藥的敏感性。隨著對(duì)蜜蜂生物學(xué)的了解,蜜蜂基因組測(cè)序提供了大量的研究蜜蜂對(duì)外源性物質(zhì)的解毒機(jī)理的新方法。迄今為止,還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)揭示蜜蜂是如何處理食物中的一些植物化學(xué)物質(zhì)、化學(xué)物質(zhì),或者其他的外源性物質(zhì)的方法。蜜蜂體內(nèi)缺少一些與解毒相關(guān)的基因,但會(huì)有一些行為機(jī)制減少毒素的吸收,這種現(xiàn)象表明蜜蜂體內(nèi)的相關(guān)基因調(diào)控不同于其他的非社會(huì)性昆蟲和食草動(dòng)物。誘導(dǎo)作用是暴露在毒素下,導(dǎo)致解毒酶含量的增加的現(xiàn)象,這種現(xiàn)象經(jīng)常誘導(dǎo)解毒基因的轉(zhuǎn)錄,這樣就可以利用最小的資源提高新陳代謝能力,保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷,這往往和p450活性增加相關(guān)。因?yàn)閜450酶常常可以被一些底物所誘導(dǎo),誘導(dǎo)效應(yīng)被當(dāng)作是識(shí)別生物體耐藥性和對(duì)外源性物質(zhì)應(yīng)答反應(yīng)的一種手段。到目前為止,只有一篇文章介紹了蜜蜂體內(nèi)p450酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)。苯比巴托、殺螨劑氟胺氰菊酯和甲黎嘧胺可以誘導(dǎo)蜜蜂體內(nèi)中單氧化酶活性增加。苯巴比妥是一個(gè)合成的巴比妥類藥物,在多種生物體內(nèi)可以誘導(dǎo)p450酶活性增加,也是蜜蜂體內(nèi)p450活性的潛在誘導(dǎo)劑。苯巴比妥可以誘導(dǎo)雙翅目、鱗翅目和蜚蠊目昆蟲的p450酶活性提高?？梢栽趯?shí)驗(yàn)室條件下采用農(nóng)藥代謝分析方法或者是以農(nóng)藥毒性為指標(biāo)的活性測(cè)定方法來(lái)測(cè)定p450酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)。盡管苯巴比妥可以誘導(dǎo)許多昆蟲體內(nèi)p450酶活性增加,但是,在膜翅目昆蟲中只做過(guò)一個(gè)苯巴比妥的研究,苜蓿切葉蜂飼喂苯巴比妥,其對(duì)胺甲萘的毒性和代謝不受影響。對(duì)于許多昆蟲,苯巴比妥在誘導(dǎo)p450酶活性增加的同時(shí),也可以誘導(dǎo)p450基因的轉(zhuǎn)錄,實(shí)驗(yàn)證實(shí)它可以誘導(dǎo)雙翅目和鱗翅目昆蟲中p450中cyp6、cyp4、cyp9家族的轉(zhuǎn)錄。飼喂苯巴比妥后,利用微芯片技術(shù)檢測(cè)到苯巴比妥誘導(dǎo)了果蠅體內(nèi)29個(gè)p450基因的表達(dá)。到目前為止,還沒(méi)有飼喂苯巴比妥可以誘導(dǎo)蜜蜂或者其他膜翅目昆蟲的p450基因的表達(dá)的報(bào)道。蜜蜂在花粉、花蜜和蜂膠中遇到的天然植物化學(xué)物質(zhì)也可能是p450解毒的誘導(dǎo)因子。事實(shí)上,蜂蜜是人體內(nèi)p450的有效誘導(dǎo)劑,盡管目前還沒(méi)有鑒定出蜂蜜中哪個(gè)特有成分誘導(dǎo)了p450的活性,但是人取食蜂蜜后,p450酶活性明顯提高。類黃酮化合物在植物抗蟲性方面具有重要作用,它在花粉和花蜜中都存在,可能會(huì)誘導(dǎo)蜜蜂體內(nèi)p450酶。槲皮素是植物葉子內(nèi)的一種常見(jiàn)類黃酮,與花粉和花蜜中的類黃酮一樣,鱗翅目幼蟲取食槲皮素后,p450基因的表達(dá)增加,p450對(duì)一些標(biāo)準(zhǔn)底物的酶活性也得到提高。蜂膠是蜜蜂采集的一種樹(shù)脂,主要用于密封結(jié)構(gòu)和抗生素,富含類黃酮化合物和酚類化合物,能夠誘導(dǎo)霉菌毒素降解過(guò)程中的p450表達(dá)。不存在于花粉、花蜜和蜂膠中的一些植物化學(xué)物質(zhì),是一些植食性昆蟲中p450調(diào)節(jié)的代謝途徑的誘導(dǎo)物。和吲哚甲醇(十字花科植物產(chǎn)生的芥子油苷毒素的一種衍生物)和水楊酸(植物抵御昆蟲取食時(shí)產(chǎn)生的一種獨(dú)特的植物激素)一樣,花椒毒素和種植的傘形科和蕓香科植物產(chǎn)生的香豆素是多數(shù)鱗翅目昆蟲中有效的p450誘導(dǎo)劑。在確認(rèn)化學(xué)物質(zhì)能夠誘導(dǎo)其他一些生物體p450酶表達(dá)的基礎(chǔ)上,可以用2種方法測(cè)定蜜蜂體內(nèi)p450的誘導(dǎo)效應(yīng),一種方法是通過(guò)測(cè)定蜜蜂對(duì)毒性物質(zhì)的耐藥性大小確定化學(xué)物質(zhì)是否對(duì)p450具有誘導(dǎo)效應(yīng);第2種方法是當(dāng)有潛在誘導(dǎo)物存在時(shí),測(cè)定p450基因轉(zhuǎn)錄的變化。在毒性測(cè)定中,測(cè)定了公認(rèn)的誘導(dǎo)物對(duì)一種農(nóng)藥LD50的影響,這種農(nóng)藥和P450相關(guān)。選擇可以被蜜蜂體內(nèi)的p450酶降解的2種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥高效氯氟氰菊酯和氟胺氰菊酯,還有2種可以被p450活化的吡蟲啉和艾氏劑,使用這種方法來(lái)測(cè)定其毒性。為了確定這些不能識(shí)別的物質(zhì)是不是p450的誘導(dǎo)物,還進(jìn)行了一個(gè)附加的毒力生物測(cè)定。蜂業(yè)生產(chǎn)中最常用的是高果糖漿和蔗糖溶液,在這些補(bǔ)充的碳水化合物中不含有田間花粉和花蜜中含有的可能對(duì)調(diào)節(jié)p450的表達(dá)具有重要作用的植物次生物質(zhì)。將這些對(duì)氟胺氰菊酯和吡蟲啉敏感的成年工蜂分別飼喂蜂蜜、蔗糖和高果糖漿,比較它們之間敏感性的差異。另外,在自然環(huán)境中存在可以調(diào)節(jié)p450的表達(dá)的黃曲霉毒素B1時(shí),比較分別飼喂糖漿、蔗糖和高果糖漿對(duì)成年工蜂壽命的影響,還對(duì)比分析了化學(xué)殺蟲劑和蜜蜂生活環(huán)境中有黃曲霉毒素時(shí)的工蜂壽命。利用特殊的蜜蜂微芯片技術(shù)分析暴露在苯巴比妥中的蜜蜂以評(píng)估苯巴比妥對(duì)蜜蜂體內(nèi)p450轉(zhuǎn)錄的影響。為了確定自然界中p450的潛在誘導(dǎo)物,在蜜蜂取食花粉、花蜜和蜂膠后,利用northern雜交分析p450中CYP6AS亞家族的表達(dá)情況。毛等人曾證實(shí)取食槲皮素后出現(xiàn)了一個(gè)新p450基因CYP6AS3來(lái)代謝槲皮素,槲皮素是廣泛存在于植物花粉、花蜜中的一類黃酮化合物。與寄生蜂金小蜂相比,蜜蜂拓展了p450中CYP6AS亞家族的基因分支,這就說(shuō)明蜜蜂p450中CYP6AS亞家族中的一些分支可能涉及到包括花粉、花蜜和蜂膠在內(nèi)的蜜蜂食物中的特殊組分的代謝。4結(jié)果4.1營(yíng)養(yǎng)物對(duì)氟胺氰菊酯和花椒毒素的影響在所有的測(cè)試誘導(dǎo)物中,只有槲皮素明顯降低了蜜蜂對(duì)氟胺氰菊酯的毒性(表1)。雖然,前期飼喂吲哚甲醇和水楊酸并沒(méi)有改變氟胺氰菊酯的毒性,但是前期飼喂苯巴比妥和花椒毒素增加了氟胺氰菊酯的毒性,飼喂苯巴比妥也增加了高效氯氟氰菊酯的毒性,但沒(méi)有對(duì)氟胺氰菊酯毒性增加的多,同時(shí),也增加了艾氏劑及其被p450分解的代謝物狄氏劑的毒性。在研究不同的飼喂物(蔗糖、高果糖漿或蜂蜜)對(duì)蜜蜂p450誘導(dǎo)能力的分析中,其中的單向方差分析法表明飼喂不同的營(yíng)養(yǎng)物對(duì)氟胺氰菊酯和吡蟲啉的毒性沒(méi)有明顯影響。因此,蜂蜜中很明顯沒(méi)有可以降解或者活化2種農(nóng)藥誘導(dǎo)p450表達(dá)的成分。4.2蜜、蔗糖不同處理的成活率利用Kaplan-Meier法分析取食不同的食物后蜜蜂對(duì)黃曲霉毒素的敏感性,單獨(dú)計(jì)算每個(gè)處理的存活中值。取食蜂蜜、蔗糖或高果糖漿的3個(gè)處理的存活中值沒(méi)有明顯差異(表2)。然而,在黃曲霉毒素B1存在時(shí),食用蜂蜜的存活中值明顯長(zhǎng)于飼喂蔗糖和高果糖漿的存活中值,3個(gè)存活中值分別為55.0h、40.9h和47.3h,這些結(jié)果表明蜂蜜中存在一種或多種成分提高了蜜蜂對(duì)黃曲霉毒素B1的耐藥性,也可能是誘導(dǎo)提高p450降解真菌毒素的能力。4.3苯巴比妥對(duì)蜜蜂跨膜四蛋白的影響接觸苯巴比妥后,只有一個(gè)跨膜四蛋白16基因表達(dá)存在明顯差異,苯巴比妥處理蜜蜂后跨膜四蛋白16基因是對(duì)照的1.4倍。沒(méi)有其他的p450基因或者與和解毒能力相關(guān)的其他基因家族參與表達(dá)。4.4cyp6as1和cyp6as3的微量元素表達(dá)飼喂不同劑量的蜂蜜提取物,有大量CYP6AS3基因表達(dá),適度的CYP6AS1和CYP6AS4表達(dá)(如圖1)。在空白對(duì)照中,這些基因的表達(dá)量非常低。CYP6AS10和CYP6AS15的表達(dá)量一直很高,這些表達(dá)與蜂蜜提取物的活化與否無(wú)關(guān)。花粉和蜂膠的提取物也可以誘導(dǎo)CYP6AS1和CYP6AS3的微量表達(dá),只有蜂膠可以誘導(dǎo)CYP6AS4,無(wú)論花粉提取物濃度的高低都可以誘導(dǎo)這些基因的表達(dá),但是必須有高濃度的蜂膠提取物才可以誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)。無(wú)論蜂膠提取物是否被消化吸收,都可以誘導(dǎo)CYP6AS10和CYP6AS15的高表達(dá)。蜂蜜提取物對(duì)蜜蜂中腸的影響提取蜜蜂腸道RNA用于微芯片分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蜜蜂所取食的自然物質(zhì)影響腸道形態(tài)。與取食蜂蜜的蜜蜂中腸相比,飼喂蔗糖的蜜蜂中腸更易碎,更柔軟,更小。為了量化這些差異,采用一種獨(dú)立的生物測(cè)定方法,定量分析取食不同食物對(duì)蜜蜂腸道的形態(tài)學(xué)特性的影響。從統(tǒng)計(jì)上看,飼喂蜂蜜提取物比那些飼喂蜂糧的蜜蜂中腸直徑大(如圖2)。飼喂不經(jīng)過(guò)處理蜂糧的蜜蜂中腸直徑小于那些飼喂含有高濃度蜂蜜的蜜蜂,飼喂低濃度蜂蜜的蜜蜂中腸寬度位于兩者之間。5蜜蜂對(duì)p450酶的耐藥能力和殘留的分析與苯巴比妥可以誘導(dǎo)其它昆蟲體內(nèi)p450s不同,蜜蜂飼喂苯巴比妥后,p450s和其他解毒基因的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生變化。而且農(nóng)藥毒性測(cè)定中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)接觸苯巴比妥之后有p450的誘導(dǎo)。苯巴比妥增加了所有農(nóng)藥的毒性,表明它和其他農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)p450調(diào)節(jié)的解毒作用。盡管在其他昆蟲中苯巴比妥不能誘導(dǎo)p450解毒,苯巴比妥增加農(nóng)藥毒性以前也沒(méi)有報(bào)道。處理蜜蜂的食物產(chǎn)生了耐藥性和毒性的不同反應(yīng),這和食物中一些成分誘導(dǎo)p450調(diào)節(jié)的解毒作用相一致。不含蜂蜜的食物顯著降低了蜜蜂對(duì)天然黃曲霉毒素B1的耐受能力,也沒(méi)有對(duì)合成藥物氟胺氰菊酯和吡蟲啉的毒性產(chǎn)生影響。雖然缺少一些酶底物活性測(cè)定,這些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)表明相對(duì)與其他昆蟲蜜蜂p450基因的調(diào)節(jié)更加特殊。這種特殊性主要體現(xiàn)在蜜蜂所取食的食物都是經(jīng)過(guò)它們自己加工處理過(guò)的蜂蜜、蜂糧或蜂王漿。當(dāng)蜜蜂遇到?jīng)]有與之共同進(jìn)化的新的外源性物質(zhì)(如吡蟲啉或者蜂巢用藥殺螨劑)時(shí),這些外源性物質(zhì)并不像這些蜂巢中常見(jiàn)的外源性物質(zhì)一樣,可以激活相應(yīng)的分子通道。盡管蜜蜂對(duì)一些化學(xué)合成藥物具有一定的耐受性,但還有許多對(duì)蜜蜂高毒,包括與氟胺氰菊酯相似的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。蜜蜂p450酶對(duì)這些農(nóng)藥的代謝作用就像一個(gè)偶然的分子結(jié)構(gòu)的聚集,而不是應(yīng)對(duì)這些農(nóng)藥的分子進(jìn)化反應(yīng)。與其它有機(jī)體p450不同,蜜蜂p450酶所降解的黃曲霉毒素B1不具有生物活性,與昆蟲適應(yīng)環(huán)境的進(jìn)化過(guò)程相一致。蜂蜜中存在的一些底物可以誘導(dǎo)或者上調(diào)p450酶的解毒活性,導(dǎo)致可能會(huì)出現(xiàn)一種可能,長(zhǎng)期飼喂蔗糖或者高果糖漿可能出現(xiàn)一些意想不到的不好的影響。高果糖漿中的果糖可以轉(zhuǎn)化為有毒性的5-羥甲基糖醛,5-羥甲基糖醛可以導(dǎo)致蜜蜂產(chǎn)生相似痢疾的癥狀和死亡。這說(shuō)明飼喂蔗糖和高果糖漿的蜜蜂可能缺乏抵抗力,當(dāng)蜜蜂接觸黃曲霉毒素B1,由于p450酶活性降低,最終對(duì)黃曲霉素耐藥能力減弱。因?yàn)槊鄯浣佑|環(huán)境中不適合的外源性物質(zhì)時(shí),不具