檢測(cè)非特異性抗體課件

第六單元

感染性疾病的免疫學(xué)檢測(cè)第六單元實(shí)驗(yàn)一乙型肝炎病毒表面抗體檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)一乙型肝炎病毒表面抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是感染性疾病的常用檢驗(yàn)方法通過乙型肝炎病毒表面抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，掌握ELISA的基本實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟熟悉影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的各種因素，學(xué)習(xí)正確分析判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果及了解檢測(cè)的臨床意義。實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿嘎?lián)免疫通過乙型肝炎熟悉影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理

采用純化的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）包被反應(yīng)板，加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入標(biāo)記了辣根過氧化物酶的HBsAg（HBsAg-HRP），當(dāng)標(biāo)本中存在抗HBs時(shí)，該抗-HBs與包被的HBsAg結(jié)合并與酶結(jié)合物結(jié)合形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP復(fù)合物，加入TMB底物顯色，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)標(biāo)本中的抗HBs含量成正比。實(shí)驗(yàn)原理采用純化的乙型肝炎表面抗原（HBsA試劑及器材包被有HBsAg的微孔板HBsAg-HRP陽性、陰性及弱陽性對(duì)照血清顯色劑，終止液酶標(biāo)儀洗板機(jī)試劑及器材取出包被好抗原的酶標(biāo)板1.加樣標(biāo)記各孔，加入50μL/孔1234陰性空白陽性待測(cè)2.加酶結(jié)合物3.顯色加入終止溶液1滴/孔，混勻酶標(biāo)儀上讀取吸光度值4.測(cè)吸光度實(shí)驗(yàn)流程各孔加入酶標(biāo)抗原1滴/孔用洗滌液洗滌5次37℃，30min甩干孔內(nèi)液體加入顯色液A、B各一滴/孔37℃，15min5弱陽性取出包被好抗原的酶標(biāo)板1.加樣標(biāo)記各孔，加入50μL/孔12操作步驟1.將包被孔編號(hào)，分別加入標(biāo)本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、弱陽性對(duì)照及空白對(duì)照各50μl。2.每孔加入酶結(jié)合物1滴（空白對(duì)照孔除外），充分混勻，置37℃孵育30分鐘。3.甩去孔中液體，加洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干。4.每孔加顯色劑A液、B液各1滴，充分混勻，置37℃孵育15分鐘。5.每孔加入終止液1滴，混勻。6.在酶標(biāo)儀上于450nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值（A），以空白孔校零點(diǎn)，分別測(cè)定陰性、陽性、弱陽性對(duì)照及樣本孔的A450值。操作步驟結(jié)果判斷

樣本孔吸光度值（S）/陰性對(duì)照孔吸光度值（N）≥2.1判斷為陽性。結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)討論ELISA是臨床常用的感染性疾病免疫學(xué)檢測(cè)方法，包括間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法、雙抗體夾心法及雙抗原夾心法等方法，討論各種方法的臨床應(yīng)用。分析ELISA檢測(cè)過程中的各種影響因素，探討本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。討論乙型肝炎病毒表面抗體檢測(cè)結(jié)果的臨床意義。實(shí)驗(yàn)討論注意事項(xiàng)加樣應(yīng)加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，避免濺出，避免產(chǎn)生氣泡。洗滌必須徹底，防止產(chǎn)生假陽性。嚴(yán)格控制溫育溫度和時(shí)間。注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)二HBsAg不同檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限

（驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)）

實(shí)驗(yàn)二HBsAg不同檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限

（驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.用已知濃度HBsAg陽性血清作系列稀釋，分別采用膠體金免疫層析法、ELISA法兩種方法將不同稀釋度的HBsAg進(jìn)行多次重復(fù)定性檢測(cè)2.將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以驗(yàn)證不同方法的最低檢測(cè)限3.初步掌握驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的原理、步驟及注意事項(xiàng)。熟悉定性檢測(cè)的性能驗(yàn)證方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.用已知濃度2.將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)3.初步掌握驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案膠體金法酶免疫技術(shù)乙肝表面抗原的定性檢測(cè)最低檢測(cè)限驗(yàn)證確定臨界值濃度

制備評(píng)價(jià)用樣本

評(píng)價(jià)方法檢測(cè)限判斷結(jié)果實(shí)驗(yàn)方案膠體金法酶免疫技術(shù)乙肝表面抗原的定性檢測(cè)最低檢測(cè)限驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理（一）

膠體金免疫層析技術(shù)

一端粘貼了含有金標(biāo)記的HBsAg抗體的硝酸纖維素膜試紙條，當(dāng)其下端浸入血清標(biāo)本后由于毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，移動(dòng)中復(fù)溶金標(biāo)記的HBsAg抗體，若標(biāo)本中含有HBsAg即可形成金標(biāo)記抗HBsAg-HBsAg復(fù)合物，該復(fù)合物移動(dòng)至測(cè)試區(qū)時(shí)，與固定在載體膜上的HBsAb結(jié)合而被固相化并顯示紅色線條（陽性條帶），多余的金標(biāo)記抗體則越過該區(qū)域并與質(zhì)控區(qū)中抗同一種屬來源的IgG結(jié)合顯示紅色（質(zhì)控條帶）。實(shí)驗(yàn)原理（一）

膠體金免疫層析技術(shù)一端粘貼AgAbAb顯色劑E將已知的純化抗體（HBsAb）吸附于固相載體上加入待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗原HBsAg）與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗體（HRP-HBsAb）形成夾心，加酶底物溶液顯色進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)原理（二）

酶免疫技術(shù)（ELISA）

雙抗體夾心法AgAbAb顯色劑E將已知的純化抗體（HBsAb）吸附于固相實(shí)驗(yàn)原理（三）定值參比血清做系列稀釋后重復(fù)檢測(cè)確定臨界值C50確定最低檢測(cè)限（+20%樣本）最低檢測(cè)限的驗(yàn)證根據(jù)C50制備評(píng)價(jià)血清-20%樣本+20%樣本實(shí)驗(yàn)原理（三）確定最低根據(jù)C50制備-20%+20%實(shí)驗(yàn)試劑及器材1.實(shí)驗(yàn)試劑HBsAg國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（濃度為5ng/ml），HBsAg質(zhì)控血清，HBsAg陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、弱陽性對(duì)照血清，

膠體金試劑盒，ELISA試劑盒，MEIA試劑盒。2.實(shí)驗(yàn)器材酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、恒溫水浴箱、吸水紙、移液器、微量加樣器吸頭等。實(shí)驗(yàn)試劑及器材1.實(shí)驗(yàn)試劑HBsAg國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（濃度操作步驟

（一）確定臨界值濃度HBsAg國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(5ng/ml)不同稀釋濃度重復(fù)檢測(cè)系列稀釋陰性結(jié)果占50%該濃度即為臨界值C50陽性結(jié)果占50%記錄結(jié)果、統(tǒng)計(jì)操作步驟

（一）確定臨界值濃度HBsAg不同稀釋濃度系列稀C5C50C95臨界值C5C50C95臨界值表1.不同濃度HBsAg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋參照表試管序號(hào)HbsAg(5ng/ml)（ul）陰性血清（ul）終體積（ul）終濃度（ng/ml）110001005280201004360401003450501002.5540601002620801001710901000.585951000.2592981000.1101991000.05110.299.81000.01表1.不同濃度HBsAg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋參照表試管序號(hào)HbsAg（二）膠體金操作方法

順序?qū)⒛z體金試紙條浸入血清（不要超過最高檢測(cè)線）5秒鐘后取出，平置，20分鐘后判斷結(jié)果。（二）膠體金操作方法（三）ELISA操作步驟加樣不同稀釋度的陽性血清（均做雙孔測(cè)定）及陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、弱陽性對(duì)照血清，分別加入對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔，留1孔做空白對(duì)照，置37℃水浴60min。加酶每孔加入酶標(biāo)記抗體50ul,空白對(duì)照孔不加，置37℃水浴30min。洗滌甩去各孔內(nèi)液體，拍干，用洗滌液洗孔6次，每次均拍干。

加酶底物/色原溶液加顯色劑A液、B液每孔各50ul，37℃水浴30min顯色。加終止液每孔50ul。讀數(shù)在酶標(biāo)儀上于450nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值（A），以空白孔校零點(diǎn)，分別測(cè)定陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、弱陽性對(duì)照及樣本孔的A值。（三）ELISA操作步驟操作實(shí)例：ELISA(雙抗體夾心法）試劑室溫平衡稀釋陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)血清順序加樣溫育加酶結(jié)合物溫育洗板洗板顯色讀取吸光度,判斷結(jié)果操作實(shí)例：ELISA(雙抗體夾心法）試劑室溫平衡稀釋陽性標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果判斷

檢測(cè)次數(shù)陽性結(jié)果次數(shù)陽性結(jié)果所占百分比C50準(zhǔn)確性判定140≤13次≤32.5%不準(zhǔn)確或不可信（統(tǒng)計(jì)學(xué)的錯(cuò)誤率為5%）≥27次≥67.5%24014～26次35%～65%準(zhǔn)確或可信

C50可信取決于實(shí)際檢測(cè)結(jié)果以及檢測(cè)的樣本數(shù)量

C50是否準(zhǔn)確的判斷：

根據(jù)濃度為C50的樣本在40次檢測(cè)中得到陽性結(jié)果的次數(shù)判斷C50是否準(zhǔn)確（表2）。表2表2判斷C50是否準(zhǔn)確結(jié)果判斷

檢測(cè)次數(shù)陽性結(jié)果次數(shù)陽性結(jié)果所占百分比C50準(zhǔn)確表3.重復(fù)檢測(cè)次數(shù)與樣本的實(shí)際濃度

陽性結(jié)果

重復(fù)性檢測(cè)總次數(shù)次數(shù)百分比真正百分比樣本的實(shí)際濃度201050%30%～70%C30～C70402050%35%～65%C35～C651005050%40%～60%C40～C60表3.重復(fù)檢測(cè)次數(shù)與樣本的實(shí)際濃度陽性結(jié)果重復(fù)性檢測(cè)表4.-20%～+20%濃度范圍是否包含了C5-C95區(qū)間

+20%陽性結(jié)果≥90%(36/40)-20%～+20%濃度范圍包含了C5～C95區(qū)間；用該方法檢測(cè)，C50±20%的樣本檢測(cè)結(jié)果一致-20%陰性結(jié)果≥90%(36/40)如果C50估計(jì)不準(zhǔn)，那么-20%到+20%濃度范圍也會(huì)變化，這將導(dǎo)致濃度范圍的一側(cè)落在C5～C95區(qū)間之外。表4.-20%～+20%濃度范圍是否包含了C5-C95區(qū)間最低檢測(cè)限的判斷若-20％濃度的樣本陰性結(jié)果次數(shù)和+20％濃度的樣本陽性結(jié)果次數(shù)符合表4，,則說明臨界值可信，而且+20％濃度即為最低檢出限。最低檢測(cè)限的判斷若-20％濃度的樣本陰性結(jié)果次數(shù)和+20％濃實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)加樣的準(zhǔn)確性：加樣及稀釋樣品時(shí)應(yīng)準(zhǔn)確標(biāo)準(zhǔn)濃度的樣品應(yīng)按濃度順序加樣，及時(shí)更換微量加樣器吸頭防止交叉污染實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置陰性、陽性、弱陽性對(duì)照和空白對(duì)照洗滌要嚴(yán)格按照要求，徹底洗滌，防止假陽性，但不可沖洗過猛過急導(dǎo)致假陰性嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間和顯色時(shí)間膠體金試條法結(jié)果應(yīng)觀察30分鐘實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)加樣的準(zhǔn)確性：加樣及稀釋樣品時(shí)應(yīng)準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行匯總、統(tǒng)計(jì)其陽性及陰性次數(shù)，并計(jì)算其陽性次數(shù)及陰性次數(shù)的百分比，以分析確定臨界值C50。在臨界值C50的基礎(chǔ)上，重復(fù)測(cè)定并記錄+20%濃度樣本的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算陽性次數(shù)及陽性次數(shù)百分比，通過對(duì)照表4分析與之是否相符，最終確定+20%是否為可信的最低檢測(cè)限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行匯總、統(tǒng)計(jì)其陽性及陰性次數(shù)實(shí)驗(yàn)小結(jié)總結(jié)本實(shí)驗(yàn)中兩種方法的最低檢測(cè)限與試劑盒的給定值是否相符?？偨Y(jié)實(shí)驗(yàn)過程中的操作是否規(guī)范，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該注意哪些問題。實(shí)驗(yàn)小結(jié)總結(jié)本實(shí)驗(yàn)中兩種方法的最低檢測(cè)限與試劑盒的給定值是否實(shí)驗(yàn)討論

基本概念：C50:是一個(gè)臨界值，是將陽性標(biāo)本做系列稀釋后，能夠獲得50%陽性和50%陰性結(jié)果的測(cè)試物的濃度，要保證C50的重復(fù)性較好應(yīng)保證該臨界濃度+20%處于95%的區(qū)間內(nèi)。C5：指一份樣本，在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中有95%的幾率獲得陰性的結(jié)果時(shí)該分析物得濃度。（低于C50濃度的20%）.C95：指一份樣本，在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中有95%的幾率獲得陽性的結(jié)果時(shí)該分析物得濃度。（高于C50濃度的20%）。？實(shí)驗(yàn)討論基本概念：？實(shí)驗(yàn)討論重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：重復(fù)檢測(cè)C5、C50、C95樣本各40次；確定每一份樣本結(jié)果為陽性和陰性的百分比；評(píng)價(jià)其臨界濃度是否準(zhǔn)確；評(píng)價(jià)+20%～-20%的濃度范圍是否包含于這種方法的95%區(qū)間。？實(shí)驗(yàn)討論重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：？實(shí)驗(yàn)三抗鏈球菌溶血素O檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)三抗鏈球菌溶血素O檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握檢測(cè)ASO的原理和方法、操作注意事項(xiàng)及結(jié)果的判斷分析2.了解不同方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)3.了解ASO檢測(cè)不同方法的臨床應(yīng)用價(jià)值實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握檢測(cè)2.了解不同3.了解ASOASO檢測(cè)方法全自動(dòng)免疫比濁法乳膠凝集實(shí)驗(yàn)

溶血抑制法定量檢測(cè)半定量檢測(cè)定性檢測(cè)采用乳膠凝聚法和全自動(dòng)免疫比濁法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過比較掌握兩種方法的原理及各自的特點(diǎn)抗鏈球菌溶血素“O”的檢測(cè)ASO檢測(cè)方法全自動(dòng)免疫比濁法乳膠凝集實(shí)驗(yàn)溶血抑制法定量檢實(shí)驗(yàn)原理一、乳膠凝集實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理一、乳膠凝集實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)試劑及器材實(shí)驗(yàn)試劑：鏈球菌溶血素“O”，10%乳膠顆粒懸液，陰性、陽性對(duì)照血清，pH8.2的甘氨酸緩沖鹽水實(shí)驗(yàn)器材：試管、反應(yīng)板、旋轉(zhuǎn)搖床、微量移液器、微量加樣器、毛細(xì)滴管等實(shí)驗(yàn)試劑及器材實(shí)驗(yàn)試劑：操作步驟致敏乳膠顆粒的制備：用蒸餾水將10%乳膠懸液稀釋至1%～2%，再將鏈球菌溶血素“O”溶于pH8.2的甘氨酸緩沖鹽水中，逐滴加入稀釋的乳劑懸液中(1%乳膠懸液1ml可吸附0.1～1mg物質(zhì)），同時(shí)搖動(dòng)使之充分混勻，放置室溫30～60min，4000r/min離心30～45min，棄上清，沉淀用同一甘氨酸緩沖鹽水恢復(fù)懸浮狀態(tài)。操作步驟致敏乳膠顆粒的制備：用蒸餾水將10%乳膠懸液稀釋至1操作步驟稀釋血清：將待檢血清、陰性血清、陽性血清分別用生理鹽水作1:20稀釋，備用。加樣：在凝集實(shí)驗(yàn)反應(yīng)板上取三格，用毛細(xì)滴管分別加入稀釋待檢血清、陽性血清、陰性血清各50ul。然后每格加入鏈球菌溶血素“O”致敏乳膠顆粒試劑1滴。反應(yīng)：反應(yīng)板充分混勻后連續(xù)搖動(dòng)2～3min后與對(duì)照比較，觀察結(jié)果。操作步驟稀釋血清：將待檢血清、陰性血清、陽性血清分別用生理鹽檢測(cè)非特異性抗體課件結(jié)果判斷“++++”全部膠乳凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明?！?++”大部分膠乳凝集，顆粒明顯，液體稍渾濁?！?+”約50%膠乳凝集，但顆粒較細(xì)，液體較渾濁“+”有少許凝集，液體呈渾濁。“-”液滴呈原有的均勻乳狀。出現(xiàn)“++”以上凝集判為陽性。結(jié)果判斷“++++”全部膠乳凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全間接乳膠凝集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果判斷間接乳膠凝集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)試劑應(yīng)充分搖勻。觀察結(jié)果應(yīng)及時(shí)，時(shí)間過長(zhǎng)易造成假陽性。血清稀釋應(yīng)準(zhǔn)確，結(jié)果判斷應(yīng)仔細(xì)觀察。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置陰性、陽性及空白對(duì)照測(cè)定ASO濃度較高樣品時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后再分析，以保證結(jié)果的可靠性。！?。。?！實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)試劑應(yīng)充分搖勻。?。。。?！全自動(dòng)速率散射比濁方法

實(shí)驗(yàn)原理可溶性抗原、抗體在液相中結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物而出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體保持中等過量時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原量增加，濁度也相應(yīng)增加。沿水平軸向反應(yīng)液照射一定波長(zhǎng)的光，當(dāng)光線通過反應(yīng)體系時(shí)，由于抗原抗體復(fù)合物微粒子對(duì)光發(fā)生折射、反射及透射、使水平方向的光發(fā)生偏轉(zhuǎn)而產(chǎn)生散射光。光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和反應(yīng)液中抗原抗體復(fù)合物的顆粒大小及多少密切相關(guān)。測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)免疫復(fù)合物形成的最快時(shí)間段的散射信號(hào)值，當(dāng)抗體量大于抗原量時(shí)，形成的免疫復(fù)合物為小分子不溶性顆粒，產(chǎn)生的散射信號(hào)最強(qiáng)，形成的速率散射信號(hào)值也最大，儀器將測(cè)得的速率峰值轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的ASO濃度。全自動(dòng)速率散射比濁方法實(shí)驗(yàn)原理試劑及器材1.全自動(dòng)速率散射比濁儀2.待檢血清、儀器配套試劑3.試管、水浴箱、移液器、微量加樣器吸頭等試劑及器材操作步驟1.開機(jī)；相關(guān)參數(shù)設(shè)置；校準(zhǔn)。2.處理標(biāo)本，3500rpm離心l0min，分離血清。3.輸入杯號(hào)；選擇所測(cè)項(xiàng)目ASO；存盤；4.編程完畢后，將標(biāo)本放入標(biāo)本杯中，且放入標(biāo)本盤中相應(yīng)位置，將所做項(xiàng)目的試劑放入試劑盤中相位置，確認(rèn)無誤后，開始運(yùn)行儀器。操作步驟結(jié)果判斷全自動(dòng)化散射比濁法：參考值范圍參見不同試劑盒。結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)討論乳膠凝集半定量實(shí)驗(yàn)及全自動(dòng)免疫比濁法定量檢測(cè)的特點(diǎn)？試應(yīng)用所學(xué)知識(shí)分析影響乳膠凝集試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素及處理方法?？實(shí)驗(yàn)討論乳膠凝集半定量實(shí)驗(yàn)及全自動(dòng)免疫比濁法定量檢測(cè)的特點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)四

梅毒螺旋體抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)四梅毒螺旋體抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握臨床常用檢測(cè)梅毒感染的方法及操作程序3.了解多種方法聯(lián)合檢測(cè)梅毒感染的臨床意義2.熟悉兩種方法的特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握臨床3.了解多2.熟悉兩種梅毒螺旋體感染的常用檢測(cè)方法TRUST（檢測(cè)非特異抗體）TPPA(檢測(cè)特異性抗體）ELISA(檢測(cè)特異性抗體）現(xiàn)癥梅毒的主要指標(biāo)同時(shí)是判斷治療效果、復(fù)發(fā)的指標(biāo)特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，但無法判斷是否為現(xiàn)癥梅毒敏感性高，有一定的假陽性率不同方法具有各自的特點(diǎn)梅毒感染檢測(cè)梅毒螺旋體感染的常用檢測(cè)方法TRUST（檢測(cè)非特異抗體）T（一）TRUST實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)原理凝集法-檢測(cè)非特異性抗體+抗心類脂抗原反應(yīng)卡滴加血清產(chǎn)生凝集現(xiàn)象抗原中加入了甲苯胺紅染料，因甲苯胺紅顆粒均勻，結(jié)果易于觀察（一）TRUST實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理+抗心類脂抗原反應(yīng)卡滴加血實(shí)驗(yàn)試劑及器材1.實(shí)驗(yàn)試劑甲苯胺紅溶液重懸的類脂抗原、陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清，2.實(shí)驗(yàn)器材滴管、反應(yīng)紙卡實(shí)驗(yàn)試劑及器材1.實(shí)驗(yàn)試劑操作步驟一、甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）

1.試劑及待檢血清室溫下平衡10min2.在樣本圈內(nèi)加入待檢血清及陰性、陽性血清，每圈50μl，盡量將血清鋪勻涂滿但不要超出卡圈3.垂直向血清中心加入抗原1滴（50μl）4.旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)卡片8分鐘后立即觀察結(jié)果操作步驟一、甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）加血清加抗原旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)觀察結(jié)果加血清加抗原旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)觀察結(jié)果結(jié)果分析甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）陰性：呈現(xiàn)粉紅色均勻分散的沉淀物陽性：出現(xiàn)粉紅色凝集塊，根據(jù)凝集塊大小可以分為4個(gè)陽性級(jí)別（1+～4+）陰性陽性弱陽性結(jié)果分析甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）陰性陽性弱陽性實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)稀釋血清應(yīng)準(zhǔn)確及避免交叉污染及時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗體濃度過高可能發(fā)生前帶現(xiàn)象而致假陰性,若TPPA或ELISA檢測(cè)結(jié)果為陽性或弱陽性，需生理鹽水稀釋樣本后重復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)稀釋血清應(yīng)準(zhǔn)確及避免交叉污染臨床意義

1.TRUST實(shí)驗(yàn)為梅毒螺旋體感染的血清學(xué)過篩試驗(yàn)，陰性不可排除感染，陽性需用特異性抗體的檢測(cè)方法進(jìn)行確認(rèn)。2.TRUST實(shí)驗(yàn)對(duì)現(xiàn)癥梅毒的診斷具有較高價(jià)值，通過連續(xù)監(jiān)測(cè)抗體滴度能夠動(dòng)態(tài)反映病程，此法在一期、二期梅毒的陽性率較高，與ELISA或TPPA檢測(cè)結(jié)果綜合分析能夠更準(zhǔn)確的診斷疾病。臨床意義1.TRUST實(shí)驗(yàn)為梅毒螺旋體感染的血清學(xué)過篩試驗(yàn)（二）TPPA法-檢測(cè)特異性抗體明膠顆粒間接凝集實(shí)驗(yàn)（TPPA法)（二）TPPA法-檢測(cè)特異性抗體明膠顆粒間接凝集實(shí)驗(yàn)（TP實(shí)驗(yàn)試劑及器材1.實(shí)驗(yàn)試劑血清稀釋液、致敏粒子、未致敏粒子以及其相應(yīng)的溶解液，陽性對(duì)照血清2.實(shí)驗(yàn)器材專用滴管、反應(yīng)板、微量加樣器、微量加樣器吸頭、移液管實(shí)驗(yàn)試劑及器材1.實(shí)驗(yàn)試劑血清稀釋液、致敏粒子、未致敏粒管號(hào)1234567稀釋液(μl)100252525252525待檢血清(μl)25252525252525未致敏顆粒(μl)--25----致敏顆粒(μl)---25252525最終稀釋倍數(shù)--1:401:801:1601:3201:64012345未致敏顆粒致敏顆粒倍比稀釋血清TPPA法操作步驟管號(hào)1234567稀釋液(μl)10025252525252結(jié)果分析

TPPA間接凝集實(shí)驗(yàn)：1）反應(yīng)圖像的判定陰性（-）：粒子集中于孔底呈紐扣狀，呈現(xiàn)外周邊緣均勻平滑的圓圈弱陽性（+）：粒子形成小環(huán)狀，呈現(xiàn)外周邊緣均勻平滑的圓圈陽性（+）：粒子環(huán)明顯變大，其外周邊緣不均勻且雜亂地凝集在周圍。強(qiáng)陽性（++）：產(chǎn)生均勻的凝集，凝集粒子在底部整體上呈膜狀延展。結(jié)果分析TPPA間接凝集實(shí)驗(yàn)：2）最終判定基準(zhǔn)：未致敏粒子的反應(yīng)圖像應(yīng)為陰性。致敏粒子（最終稀釋度1:80及以上）反應(yīng)圖像為陽性，最終應(yīng)判定為陽性。反應(yīng)圖像為陽性的最終稀釋倍數(shù)作為抗體效價(jià)。

1:401:80未致敏顆粒陰性致敏顆粒陽性陽性對(duì)照最終判斷：陽性待檢血清2）最終判定基準(zhǔn)：未致敏粒子的反應(yīng)圖像應(yīng)為陰性。致敏粒子（最注意事項(xiàng)1.試劑及檢測(cè)樣品應(yīng)充分混勻，及時(shí)更換加樣吸頭避免交叉污染。2.實(shí)驗(yàn)中不能隨意移動(dòng)反應(yīng)板，否則容易造成假陽性。3.保證足夠的反應(yīng)時(shí)間、及時(shí)觀察結(jié)果。4.陽性結(jié)果用另一種方法如ELISA法復(fù)查。注意事項(xiàng)1.試劑及檢測(cè)樣品應(yīng)充分混勻，及時(shí)更換加樣吸頭避免交臨床意義

梅毒螺旋體感染后2周左右患者血清中即可出現(xiàn)特異性IgM抗體，4周左右即可檢測(cè)出特異性IgG抗體，TPPA法為檢測(cè)特異性IgG抗體的較好方法之一，其陽性可以提示曾經(jīng)或現(xiàn)在感染梅毒，與TRUST法的檢測(cè)結(jié)果綜合分析對(duì)梅毒的診斷、分期及治療效果評(píng)價(jià)具有重要價(jià)值。臨床意義實(shí)驗(yàn)討論梅毒血清學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)梅毒診斷有何意義？？實(shí)驗(yàn)討論梅毒血清學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)梅毒診斷有何意義？？實(shí)驗(yàn)討論TRUST法檢測(cè)非特異性抗體，是現(xiàn)癥梅毒患者實(shí)驗(yàn)室診斷的重要指標(biāo)，但初期或晚期梅毒病人抗體濃度較低可出現(xiàn)假陰性，抗體濃度過高時(shí)出現(xiàn)前帶現(xiàn)象也可出現(xiàn)假陰性，而某些疾病如自身免疫性疾病則可出現(xiàn)假陽性。TRUST檢測(cè)的非特異性抗體在感染1-2周即可出現(xiàn)，如滴度≥1∶4，又具有典型的臨床表現(xiàn)，則現(xiàn)癥梅毒的可能性較大。需注意TRUST檢測(cè)結(jié)果陽性需謹(jǐn)慎對(duì)待，低滴度(≤1∶4)除可能為生物學(xué)造成的假陽性外，還有可能是發(fā)病初期或使用抗生素延長(zhǎng)了陽性血清出現(xiàn)的潛伏期。TRUST滴度與病情活動(dòng)呈正相關(guān)，并且可作為判定復(fù)發(fā)或再感染指征,對(duì)于高滴度者(≥1∶8)應(yīng)考慮為現(xiàn)癥梅毒病人，并結(jié)合臨床癥狀給予適當(dāng)治療。？實(shí)驗(yàn)討論TRUST法檢測(cè)非特異性抗體，是現(xiàn)癥梅毒患者實(shí)驗(yàn)室診實(shí)驗(yàn)討論ELISA檢測(cè)梅毒抗體具有較高的敏感性，并可用全自動(dòng)酶標(biāo)儀進(jìn)行批量初篩，但特異性稍差，有一定的假陽性率，采用ELISA兩步法可在一定程度上提高檢測(cè)結(jié)果的敏感性和可靠性。TPPA法特異性及敏感性均較高，可作為ELISA法及TRUST法篩查的確證實(shí)驗(yàn)。但該方法操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)。ELISA和TPPA兩種方法檢測(cè)的梅毒抗體均為特異性抗體，該抗體即使經(jīng)治療后也可終生陽性，因此不能作為評(píng)價(jià)治療效果，復(fù)發(fā)或再感染的指標(biāo)。？實(shí)驗(yàn)討論ELISA檢測(cè)梅毒抗體具有較高的敏感性，并可用全自動(dòng)實(shí)驗(yàn)討論綜合應(yīng)用特異性抗體和非特異性抗體兩種方法檢測(cè)及滴度分析不僅能夠提高梅毒感染檢測(cè)的敏感性和特異性，同時(shí)能夠進(jìn)行療效觀察，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷，早期治療梅毒患者以及有效控制梅毒流行具有重要意義。？實(shí)驗(yàn)討論綜合應(yīng)用特異性抗體和非特異性抗體兩種方法檢測(cè)及滴度分實(shí)驗(yàn)五

人類巨細(xì)胞病毒抗體IgM檢測(cè)實(shí)驗(yàn)五人類巨細(xì)胞病毒抗體IgM檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^ELISA捕獲法檢測(cè)HCMV-IgM抗體的操作

掌握ELISA捕獲法檢測(cè)HCMV-IgM的實(shí)驗(yàn)原理及操作程序熟悉方法的特點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^ELISA捕獲掌握ELISA捕獲熟悉方法的特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理用抗人IgM（u鏈）包被微孔板，與待檢血清反應(yīng)，使血清中所有IgM（特異性與非特異性IgM）均被捕獲，經(jīng)洗滌除去IgG，加入HCMV抗原，與固相上捕獲的特異性IgM結(jié)合，加入針對(duì)HCMV抗原的酶標(biāo)抗體形成固相二抗-IgM-抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物，在底物酶的作用下顯色，根據(jù)吸光度判斷是否存在HCMV特異性抗體IgM及抗體量。實(shí)驗(yàn)原理用抗人IgM（u鏈）包被微孔板，與待檢血清反應(yīng)，使血實(shí)驗(yàn)試劑及器材1.實(shí)驗(yàn)試劑抗CVBIgM陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、弱陽性對(duì)照、血清，抗人IgM（u鏈），稀釋液，底物A、底物B，終止液。2.實(shí)驗(yàn)器材包被有CVB抗原的微孔板、微量移液器、微量加樣器吸頭、試管、恒溫水浴箱實(shí)驗(yàn)試劑及器材1.實(shí)驗(yàn)試劑抗CVBIgM陽性對(duì)照、陰性對(duì)操作步驟1.稀釋待測(cè)樣本2.溫育3.洗滌4.加抗原5.洗滌同步驟36.加酶結(jié)合物7.洗滌同步驟38.加酶底物/色原溶液9.加終止液10.酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值操作步驟1.稀釋待測(cè)樣本結(jié)果判斷采用反應(yīng)底物的最大吸收波長(zhǎng)即（450nm）處測(cè)定各孔吸光度值。以樣本孔吸光度值（S）/陰性對(duì)照孔吸光度值（N）>1.0時(shí)判定為陽性。結(jié)果判斷采用反應(yīng)底物的最大吸收波長(zhǎng)即（450nm）處測(cè)定各孔注意事項(xiàng)1.實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置陰性、陽性、弱陽性、和空白對(duì)照。2.洗滌要嚴(yán)格按照要求，徹底洗滌，防止假陽性，但不可沖洗過猛過急導(dǎo)致假陰性。3.嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間和顯色時(shí)間。注意事項(xiàng)1.實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置陰性、陽性、弱陽性、和空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)討論1.捕獲法的靈敏度和特異性均強(qiáng)于間接法,請(qǐng)分析原因?捕獲法是以抗人IgM抗體(抗人μ鏈)作為固相抗體，當(dāng)加入血清標(biāo)本時(shí)，其中的IgM類抗體(特異的和非特異的)即可被固相抗體捕獲，而IgG則被洗去，再加入特異抗原可與固相上捕獲的特異性IgM抗體結(jié)合，而不與非特異性IgM結(jié)合，這樣非特異性IgM及IgG均被除去，排除了非特異性IgM等干擾因素。？實(shí)驗(yàn)討論1.捕獲法的靈敏度和特異性均強(qiáng)于間接法,請(qǐng)分析原因?實(shí)驗(yàn)討論間接法易受RF因子及非特異性IgM的影響。間接法測(cè)定時(shí)，血清中特異的IgG與包被的特異性抗原結(jié)合，而后與RF反應(yīng)造成假陽性。同時(shí)，特異性的IgG能與IgM競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗原而造成假陰性。捕獲法利用抗人IgMμ鏈直接從被檢血清中捕獲IgM,再進(jìn)行特異性結(jié)合，避免了RF等干擾物質(zhì)的影響，具有更強(qiáng)的特異性。？實(shí)驗(yàn)討論間接法易受RF因子及非特異性IgM的影響。間接法測(cè)實(shí)驗(yàn)討論

請(qǐng)結(jié)合所學(xué)知識(shí)，分析酶聯(lián)免疫技術(shù)中其他方法的優(yōu)點(diǎn)及缺陷。？實(shí)驗(yàn)討論請(qǐng)結(jié)合所學(xué)知識(shí)，分析酶聯(lián)免疫技術(shù)中病案討論病案討論患者，男，49歲主訴“右上腹隱痛、腹脹隱痛8年，反復(fù)牙齦出血2年”體格檢查：鞏膜黃染，腹壁靜脈曲張，肝臟于肋下4橫指可觸及，質(zhì)硬，壓痛，腹水征陽性。CT示：肝左葉大，肝裂增寬。實(shí)驗(yàn)室檢查：HGB:115g/L，WBC：5.4X109/L，NEU:41.6%，LYM:57.3%,PLT：96X109/L血清抗HCV抗體：陽性，HCV-RNA：9.26X104copies/ml,其余肝炎病毒血清標(biāo)志物檢查均為陰性，肝功能：ALB:29.6g/L，GLB:37.4g/LA/G:0.8，PA:54mg/L，ALT:146U/L，AST:249U/L，ALP:213U/L，r-GGT:169U/L，CHE:1858U/L，TBA:130.4umol/L，T-Bil:46.1mmol/L,D-Bil：26.8mmol/L，LDH:,337U/L,a-HBD:234U/L。問題：

請(qǐng)結(jié)合以上資料，分析該患者可能的診斷及實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)？病例一患者，男，49歲主訴“右上腹隱痛、腹脹隱痛8年，反復(fù)牙齦出血患者右上腹隱痛不適、腹脹8年，肝脾腫大，腹壁靜脈曲張，腹水征陽性，提示存在門脈高壓，伴腹水，肝臟血清酶增高明顯，膽紅素升高；應(yīng)考慮肝硬化或肝癌。近兩年反復(fù)出現(xiàn)牙齦出血，考慮因肝臟合成凝血因子減少以及脾功能亢進(jìn)致血小板減少導(dǎo)致凝血功能障礙所致。提示肝臟功能已經(jīng)失代償，出現(xiàn)肝功能嚴(yán)重受損的各種癥狀。丙型肝炎病毒抗體陽性，HCV-RNA拷貝數(shù)高，提示病因?yàn)楸透窝撞《靖腥?，肝脾增大，影像學(xué)檢查無肝內(nèi)占位性病變，可排除肝癌。診斷：丙型肝炎后肝硬化肝功能失代償期。

答案提示患者右上腹隱痛不適、腹脹8年，肝脾腫大，腹壁靜脈曲張，腹水征患者，女性，25歲，主訴“會(huì)陰部皮疹3月余，全身皮疹伴腹股溝淋巴結(jié)腫大半月余”體格檢查：肛門周圍及外陰部大小陰唇間有隆起的丘疹，部分融合，表面平坦，表面濕爛，有少許滲出液。雙側(cè)下頜、頸前、腹股溝處可捫及多個(gè)拇指大小腫大淋巴結(jié)，輕壓痛。實(shí)驗(yàn)室檢查：血清TRUST陽性，TPPA陽性，滴度為1:640，宮頸分泌物查衣原體抗體陰