耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的分離鑒定

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的分離鑒定

隨著碳綠霉素的大量使用和不合理的使用，以及碳綠霉素類抗生素的肺炎克雷伯菌（crkp）逐漸增加，給臨床抗感染治療帶來(lái)了困難。crkp感染已成為醫(yī)院死亡的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外抗感染研究熱點(diǎn)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株分布及質(zhì)控指標(biāo)耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株29株全部來(lái)自連云港第一人民醫(yī)院2013年1月—2014年6月臨床送檢標(biāo)本,其中分離自痰標(biāo)本24株,血標(biāo)本3株,尿標(biāo)本1株,分泌物標(biāo)本1株,病區(qū)分布:重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)8株,神經(jīng)內(nèi)科病區(qū)10株,神經(jīng)外科病區(qū)7株,呼吸內(nèi)科病區(qū)3株,兒內(nèi)科病區(qū)1株。所有菌株均經(jīng)MicroScanWalkAway96全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn),質(zhì)控菌株為ATCC25922、ATCC27853。入選標(biāo)準(zhǔn)為厄他培南、亞胺培南或美羅培南三種碳青霉烯藥物任一耐藥,同時(shí)剔除同一患者的重復(fù)分離株。1.1.2試劑與儀器3-氨基苯硼酸水合物(3-Aminophenylboronicacidmonohydrate,APBA)(購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、注射用氯唑西林鈉(北京賽孚制藥股份有限公司)、MH瓊脂干粉、厄他培南(10μg)、美羅培南(10μg)藥敏紙片(均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司)、PCRMaster試劑盒、DNAMarker、50×TAE、PCR擴(kuò)增引物(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)、穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱、超速離心機(jī)、veriti96-孔熱循環(huán)PCR擴(kuò)增儀、紫外凝膠成像與分析儀等。1.2方法1.2.1碳綠霉酶表型篩選參照有關(guān)文獻(xiàn)[3],用無(wú)菌生理鹽水將待測(cè)菌株菌懸液調(diào)至1.5×101.2.2碳青霉烯酶基因型的確認(rèn)加熱煮沸法提取細(xì)菌DNA1.2.3pfgi試驗(yàn)和mlst分類測(cè)試菌株的PFGE實(shí)驗(yàn)根椐有關(guān)報(bào)道方法作適當(dāng)改進(jìn)2結(jié)果2.1抗菌藥物敏感試驗(yàn)所有測(cè)試菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物100%耐藥,只有部份菌株對(duì)氨基糖苷類、氟喹諾酮和四環(huán)素表現(xiàn)敏感,但這幾種藥物的總的耐藥率均在93%以上。見(jiàn)表2。2.2碳青霉烯酶的篩選碳青霉烯酶表型篩選試驗(yàn)29株均為陽(yáng)性(美羅培南MEM抑菌圈直徑<25mm),雙紙片增效試驗(yàn)對(duì)29株CRKP進(jìn)行碳青霉烯酶型篩選結(jié)果顯示,26株(89.7%)產(chǎn)A類碳青霉烯酶,如圖1。7933號(hào)對(duì)MEM和ETP均≤6mm,對(duì)ETP加APBA與不加APBA抑菌圈直徑相差>5mm,為產(chǎn)A組碳青霉烯酶;2株(6.9%)產(chǎn)B類金屬酶,如圖2。8127號(hào)標(biāo)本對(duì)MEM和ETP均≤6mm,對(duì)ETP加EDTA與不加EDTA抑菌圈直徑相差>5mm,為產(chǎn)B組金屬酶;1株(3.4%)A、B兩類酶篩選試驗(yàn)均為陰性。2.3kpc陽(yáng)性目的譜帶和b類酶基因型篩選經(jīng)PCR擴(kuò)增6種碳青霉烯酶的基因,28株碳青霉烯酶酶型篩選陽(yáng)性菌株均擴(kuò)增出相關(guān)陽(yáng)性目的條帶,其中26株表型篩選為A類酶,KPC基因擴(kuò)增陽(yáng)性,如圖3。標(biāo)本號(hào)為7933、7700、8007、8838、8993的菌株均擴(kuò)增出KPC陽(yáng)性目的條帶,基因序列經(jīng)BLAST網(wǎng)上比對(duì)顯示均為KPC-2型;2株表型篩選為B類酶,其中一株NDM基因擴(kuò)增陽(yáng)性,另一株VIM基因擴(kuò)增陽(yáng)性,如圖4。標(biāo)本號(hào)為8127的菌株擴(kuò)增出NDM-1陽(yáng)性目的條帶,基因測(cè)序經(jīng)BLAST網(wǎng)上比對(duì)分別為NDM-1、VIM-2型碳青霉烯酶,如圖5。BLAST比對(duì)顯示本次試驗(yàn)中檢出的NDM-1耐藥基因與Genbank公布的NDM-1耐藥基因gb|JN697592.1|同源性為99%。表型篩選試驗(yàn)A、B類碳青霉烯酶陰性1株未測(cè)出A、B類碳青霉烯酶相關(guān)基因。2.4pfga和mlst分類29株實(shí)驗(yàn)菌株的PFGE分型顯示,29株CRKP共分為9種不同的PFGE帶型,以70%相似度為標(biāo)準(zhǔn)3碳青霉烯酶檢測(cè)crkp的敏感性分析近年來(lái)隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用,耐碳青霉烯腸桿菌分離率不斷增加產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗菌藥物的主要機(jī)制,自美國(guó)于2001年首先報(bào)道在一株1996年分離的耐藥肺炎克雷伯菌中檢測(cè)到KPC-1酶以來(lái)臨床實(shí)驗(yàn)室需要一種簡(jiǎn)單有效的方法快速檢出產(chǎn)碳青霉烯酶菌株,改良Hodge(MHT)試驗(yàn)和CarpaNP試驗(yàn)是CLSI推薦作為碳青霉烯酶表型確證試驗(yàn),但這兩種方法在敏感性上還存在一些問(wèn)題,特別是對(duì)產(chǎn)AmpC酶菌株和膜通道蛋白缺失菌株檢測(cè)的敏感性不夠同源性結(jié)果顯示,本次實(shí)驗(yàn)的29株CRKP可分為3個(gè)不同的群,26株產(chǎn)KPC-2型酶菌株為同一群,其中17株的條帶完全相同,為同一型,這17株分別分離自不同科室非同一時(shí)間的不同標(biāo)本,說(shuō)明本院存在著產(chǎn)酶菌株在不同科室間的傳播和流行,應(yīng)引起臨床各科室和醫(yī)院感染控制部門的高度重視,采取有效措施切斷傳播途徑,控制耐藥株的流行。MLST的結(jié)果顯示本院主要的流行菌株為ST11型,這和國(guó)內(nèi)報(bào)道的流行