產(chǎn)金屬-內(nèi)酰胺酶銅綠假單胞菌的檢測(cè)及耐藥性分析

產(chǎn)金屬-內(nèi)酰胺酶銅綠假單胞菌的檢測(cè)及耐藥性分析

銅綠假單胞菌是常見的臨床感染病原體。近年的研究表明,臨床使用碳青霉烯類藥物治療多重耐藥銅綠假單胞菌感染時(shí),發(fā)現(xiàn)耐亞胺培南的銅綠假單胞菌逐年增多,產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-beta-lactamase,MBL)菌株已成為目前耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制研究中的熱點(diǎn)。本研究對(duì)30株耐亞胺培南銅綠假單胞菌進(jìn)行金屬酶表型分析,同時(shí)檢測(cè)bla11.1材料表面1.1.1篩選待測(cè)菌株收集2006-08/2007-02臨床分離的銅綠假單胞菌,并經(jīng)K-B法篩選對(duì)亞胺培南耐藥株作為待測(cè)菌株,共計(jì)30株。銅綠假單胞菌ATCC27853作為陰性質(zhì)控菌,購于山東省臨床檢驗(yàn)中心,銅綠假單胞菌產(chǎn)IMP-1型和VIM-2型金屬酶的陽性對(duì)照菌株由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院惠贈(zèng)。1.1.2儀器和主要試劑7600型DNA擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司);EDTA-Na1.2方法1.2.1細(xì)菌的鑒定用法國(guó)生物梅里埃公司ATBExpressionID32GN鑒定系統(tǒng)操作。1.2.2e-todta和ipm對(duì)菌株k-b法藥敏試驗(yàn)結(jié)果EDTA紙片復(fù)合法以亞胺培南為金屬β-內(nèi)酰胺酶底物,以EDTA-NaEDTA-Na將受試細(xì)菌制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木?在直徑90mm的M-H瓊脂平板上涂布受試細(xì)菌,按K-B法藥敏試驗(yàn)方法,采用亞胺培南(IPM,10μg)紙片,并將500mmol/LEDTA10μl加至上述紙片制得IPM/EDTA紙片,按K-B紙片法測(cè)出IPM,IPM/EDTA紙片的抑菌圈直徑。EDTA能使相應(yīng)抗菌藥物的抑菌圈直徑擴(kuò)大≥5mm者E-test法檢測(cè):在直徑90mm的M-H瓊脂平板上,按K-B法藥敏試驗(yàn)方法接種待測(cè)菌后,在正中帖上IP/IPIE-testMBL試紙條,MIC刻度面朝上,35℃溫箱孵育16～18h,觀察結(jié)果。E-test金屬β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)條由兩邊7倍稀釋范圍的IPM(4～256μg/ml)和上面覆蓋有EDTA的IPM(1～64μg/ml)構(gòu)成。用銅綠假單胞菌ATCC27853作為陰性質(zhì)控菌,質(zhì)控范圍:(IP)IPMMIC≤4μg/ml,(IPI)IPM+EDTAMIC在1～4μg/ml;測(cè)試菌株結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為:如果IP/IPI≥3倍稀釋度為陽性1.2.3蛋白酶k溶液蛋白酶K消化法:挑取過夜純培養(yǎng)菌落置入0.5ml離心管(內(nèi)已預(yù)制200ng/ml蛋白酶K溶液),56℃水浴2h,改95℃水浴10min。15000r/min離心30s,取上清液移入另一新的0.5ml離心管作為模板液,置入-20℃冰箱備用。1.2.4pcr和引物擴(kuò)增所用引物參照GenbankblaGCTTGGTTTTGATGG-3’,產(chǎn)物長(zhǎng)度為741bp;VIM-F:5’-ATGTTCAAACTTTTGAGTAA-3’,VIM-R:5’-CTACTCAACGACTGAGC-3’,產(chǎn)物長(zhǎng)度為801bp。PCR引物委托大連寶生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25μl:Taq(5U/μl)0.2μl,10×PCRBuffer2.5μl,dNTPMixture2μl,模板DNA2μl,引物F(20μmol/L)0.5μl,引物R(20μmol/L)0.5μl,滅菌蒸餾水(ddHblaPCR全過程以產(chǎn)IMP-1型金屬酶銅綠假單胞菌菌株做為擴(kuò)增bla1.2.5菌株質(zhì)控菌株抗菌藥物共有8種,分別是亞胺培南(IPM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢哌酮(CFP)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、環(huán)丙沙星(CIP)、氨曲南(ATM)、左氧氟沙星(LEV),質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)參照2005年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSL)的臨界值22.1-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)劑的結(jié)果30株耐亞胺培南銅綠假單胞菌,EDTA紙片復(fù)合法篩選9株產(chǎn)金屬酶菌株;E-test法篩選6株產(chǎn)金屬酶菌株。見表1。2.2抗癲癇基因的檢測(cè)目標(biāo)基因bla2.3內(nèi)酰胺金屬絲的mic值見表2。3金屬酶檢測(cè)藥物抗菌活性應(yīng)符合以下5銅綠假單胞菌是引起院內(nèi)感染的條件病原菌之一,其對(duì)多種抗生素易產(chǎn)生耐藥性,使治療十分困難。以往對(duì)銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的研究中,多是該菌產(chǎn)染色體介導(dǎo)的AmpC酶和(或)外膜滲透性降低或抗生素泵出機(jī)制,并發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制主要是外膜孔蛋白OprD2缺失引起的金屬β-內(nèi)酰胺酶又稱金屬酶,它屬于Ambler分子結(jié)構(gòu)分類中的B類和Bush功能分類中的第3組。金屬酶能水解除單環(huán)類抗菌藥物以外的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素,使細(xì)菌對(duì)青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類耐藥。1991年日本學(xué)者Osano等金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)。IMP-1基因大多數(shù)位于質(zhì)粒上,而VIM-2基因主要存在于染色體上,僅少數(shù)存在于質(zhì)粒上本研究采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)8種抗菌藥物對(duì)產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶銅綠假單胞菌的MIC值,結(jié)果提示產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶銅綠假單胞菌對(duì)頭孢他啶(MIC≥64μg/ml)、亞胺培南(MIC≥32μg/ml)耐藥大多表現(xiàn)為高水平耐藥。上述資料可以看出產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶銅綠假單胞菌選擇抗菌藥物的范圍很窄,阿米卡星抗菌活性最好,其次為環(huán)丙沙星。阿米卡星對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的氨基糖苷類鈍化酶較穩(wěn)定,具有良好的抗菌活性,但氨基糖苷類藥物有耳、腎毒性,臨床應(yīng)用中應(yīng)注意監(jiān)測(cè)。治療多重耐