WesternBlot常見問題及處理總結(jié)

(50(502(中班上學(xué)期期末考試卷1免疫細(xì)胞爭論westernblotWesternBlot常見問題及處理總結(jié)阿木1、westernblot的優(yōu)點答：靈敏，可達(dá)ngEcl顯色法理論上可pg級。便利，特異性高。2:a)你的細(xì)胞中不表達(dá)這種b)你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需參與PMSF，抑制蛋白酶活性；是否有問題。3為什么呢？2答：a)SDS濃度，同時將樣品煮沸時間延長，b)也不排解你的抗原濃度過高，這時再參與適量上樣緩沖液即可。4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小10KDWB？答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。5、我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。(50(502(中班上學(xué)期期末考試卷106、膠片背景很臟，有什么解決方法？答：削減抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋D(zhuǎn)變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。7、目標(biāo)帶是空白，四周有背景，是為什么？HRP催化活力太強(qiáng)，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反響時間不長，將四周底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q底物。8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？答：假設(shè)能夠排解下面的幾個問題那么問題多半消滅在一抗和抗原制備上。二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c)ECL底物沒掩蓋到相應(yīng)位置；d) 二抗失活。9、我在顯影液中顯影15分鐘后,底片漆黑一片,是什么緣由呢?答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片原來就被曝光了，可以在完全黑暗的狀況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時間過長。10、DABECM好？答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 敏感的底物；ECM結(jié)果簡潔把握，但被催化時靈敏度差一點，但假設(shè)到達(dá)閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你試驗的狀況。11、抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以翻開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時Marker轉(zhuǎn)上去了，為什么？13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否確定NaF等？答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大局部時候是不用加的。14、要驗證某個細(xì)胞上有無該蛋白的存在，westernblot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？①免疫組化可以用來進(jìn)展定位，但是不能準(zhǔn)確定量，而且有時會有假陽性，不易與背分子，進(jìn)展定量，但是不能定位。②兩種試驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進(jìn)展什么試驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。〔未加蛋白酶抑制劑點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，PMSF行嗎？反復(fù)凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。westernblot？5×10^6就足夠了17RNA又提蛋白么？這westernblot有無影響？答：能，沒有問題。18、同一蛋白樣品能同時進(jìn)展兩種因子的WesternBlot檢測嗎？答：固然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。19、假設(shè)目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要留意什么？答：假設(shè)是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫存得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時常常會覺察只有一局部蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠覺察有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么方法可以解決？答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時你可以用削減電流延長時間，加20％甲醇。200kd的，SDS-電泳的分別膠濃度多大適宜？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白簡潔作WesternBlot嗎？7％，積層膠3.5％。22、假設(shè)上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？答：可以濃縮樣品，也可以依據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一局部小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。假設(shè)已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可1.5mm的。23、蛋白變性后可以存放多久？答：－80℃，一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：(也是被酶水解了)。說分別膠應(yīng)當(dāng)承受7.5%，但資料卻要求分別膠和濃縮膠均承受11％的配方，不知為何？答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，由于105KD的蛋白在上述兩種膠的線性區(qū)分范圍內(nèi)，但需留意條帶位置。25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知承受這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？似乎有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？解答：不能使用脫脂奶粉，由于脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應(yīng)當(dāng)好一點．26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？答：WesternBlot30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的開頭摸條件時，為了拿到陽性結(jié)果，各個步驟都要拿到好的結(jié)果，假設(shè)抗體好的話比較簡潔，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，固然有的不適合WesternBlot的怎樣做也不行。27western的時候，怎樣處理樣品？答：必需進(jìn)展研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要留意抑制蛋白酶的活性〔參與ＰＭＳＦ。28200KDwestern要留意什么呢？200kdWesternBlot時要留意，分別膠最好選擇>7%的；剝膠時要留神；轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照〔否則消滅雜帶不知道如何分析。(50(502(中班上學(xué)期期末考試卷1429、有什么方法可以提高上樣量？答：a)可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量；b)5倍的上樣緩沖液來稀釋變性30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？則上樣量要均多上就行了，但是不要超載.31、一抗，二抗的比例是否重要？答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉局部非特異的本底。有何要求？HRP標(biāo)記的二抗。WesternBlot可以用同一種抗體嗎？答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原打算簇〔又稱表位而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，自然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間構(gòu)造限制，煮后變性會消逝。假設(shè)你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基(50(502(中班上學(xué)期期末考試卷25酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于位，則只能用于免疫組化。34、WesternBlot 中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？2－3后應(yīng)在2－3泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？答：可以。37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？延長轉(zhuǎn)移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。時，同樣的抗體免疫組WesternBlot卻不能？WesternBlot和免疫組化。396×8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀釋度是有說明的，依據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能到達(dá)最正確效果。答：無特別要求。但我們一般是上槽放穎的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液41、跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了；也可能母液〔30%聚丙酰胺〕有問題，你可以重配制一份觀看；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分別小嗎？21kd，濕轉(zhuǎn)120mA45-60min室的閱歷調(diào)整；170kd 90-120min。43轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中參與20%甲醇〔是指終濃度，由于甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合力氣，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使NC膜〔0.2微米〕.8條帶，請問什么緣由？怎樣改善？膠用過marker是買的。答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或削減電泳時間試試看。固然梯度膠也是不錯的選擇。WesternBlot試驗半定量確定要加ACTIN內(nèi)參？答：對于發(fā)表文章的試驗最好加內(nèi)參，試驗嚴(yán)謹(jǐn)。46WesternBlot內(nèi)參選擇什么合適？答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。GAPDH哪個好？beta-actin就可以。48、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)分嗎？答：一般來說提取時參與廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特別的方法，一般來說都沒有區(qū)分。5%TBST脫脂奶粉”TBSTTTween嗎，濃度多大？水800ml溶解,加500-1000ul的Tween-20,HClpH至7.4,加水定容至1L.50、封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比方在室溫里做，或者要在4度下?答：均可在室溫進(jìn)展，假設(shè)時間不夠，一抗4度過夜。原理是什么？答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，F(xiàn)不易脫落，結(jié)果較好。52、怎樣才能把膠跑的格外秀麗，泳道都能很直，上樣的量和