111例無(wú)菌體液標(biāo)本中CRE的碳青霉烯酶檢測(cè)及同源性分析

111例無(wú)菌體液標(biāo)本中CRE的碳青霉烯酶檢測(cè)及同源性分析*

周文艷，張華△，許永杰1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州遵義563000；2.貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽(yáng)550000抗菌藥物在治療細(xì)菌感染方面發(fā)揮了巨大的作用，但隨著抗菌藥物的大量使用，細(xì)菌耐藥問(wèn)題也日漸嚴(yán)重[1]。耐藥菌的出現(xiàn)給患者及家庭帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且威脅患者生命健康[2]。碳青霉烯類抗菌藥物可與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合并阻止肽聚糖合成，導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡[3]。因該藥具有抗菌譜廣、毒性相對(duì)較低、不產(chǎn)生交叉耐藥等特點(diǎn)，被認(rèn)為是治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的首選藥物[4]。因近年來(lái)碳青霉烯類抗菌藥物使用增加，耐碳青霉烯類抗菌藥物的細(xì)菌也隨之增加，而耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)的出現(xiàn)成為關(guān)注的焦點(diǎn)[5]?；颊吒腥驹摼笈R床可用藥物少，病死率高，尤其是在無(wú)菌體液中檢出的CRE，絕大多數(shù)為侵襲性感染，治療藥物更有限，病死率更高[6]。因此，本研究主要分析貴州省人民醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱本院)2019年6月至2021年6月收集的無(wú)菌體液標(biāo)本中CRE的耐藥情況和同源性，旨在為本院院內(nèi)感染防控和臨床合理用藥提供參考依據(jù)，預(yù)防及減少CRE的產(chǎn)生。1資料與方法1.1一般資料選擇本院2019年6月至2021年6月門(mén)診及住院患者送檢的無(wú)菌體液標(biāo)本中檢出的111株CRE為研究對(duì)象，剔除同一患者相同標(biāo)本類型的重復(fù)菌株。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，碳青霉烯抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)質(zhì)控菌株為經(jīng)測(cè)序攜帶blaKPC的肺炎克雷伯菌、攜帶blaNDM的大腸埃希菌，脈沖場(chǎng)凝膠電泳質(zhì)控菌株為沙門(mén)菌H9812，所有質(zhì)控菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2CRE的判定對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南其中任意一種碳青霉烯類藥物耐藥的腸桿菌科細(xì)菌。1.3儀器與試劑BDphoenix-100細(xì)菌鑒定藥敏儀(美國(guó)BD公司)，VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀及配套試劑(法國(guó)梅里埃公司)；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀及配套設(shè)備(美國(guó)伯樂(lè)公司)，恒溫水浴箱及恒溫振蕩器(常州奧華儀器有限公司)，脈沖場(chǎng)電泳小膠塊清洗器(成都蘭博易生物科技有限公司)。亞胺培南和美羅培南藥敏試驗(yàn)紙片(上海賽默飛有限公司)；哥倫比亞血平板、MH平板(廣州迪景科技有限公司)；Seakemgold瓊脂糖(美國(guó)Lonza公司)，XbaⅠ內(nèi)切酶(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，蛋白酶K(北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司)，NG-TestCARBA5碳青霉烯酶檢測(cè)試劑盒(長(zhǎng)沙復(fù)星診斷科技有限公司)。1.4方法1.4.1細(xì)菌鑒定及藥敏采用BDphoenix-100或VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，K-B法或E-test法對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，抗菌藥物敏感性判定參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)2020年發(fā)布的藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)。1.4.2表型和基因型檢測(cè)碳青霉烯酶表型檢測(cè)和基因型檢測(cè)分別采用文獻(xiàn)[7]中推薦的碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)和膠體金免疫層析法。1.4.3同源性分析應(yīng)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)對(duì)91株肺炎克雷伯菌株進(jìn)行同源性分析，將細(xì)菌培養(yǎng)18～20h，采用比濁儀將待測(cè)菌調(diào)為3.7～4.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木?，加入蛋白酶K，1%SeakemGold，混勻制備膠塊；用細(xì)胞裂解液在56℃水浴搖床中裂解3h；56℃的TE緩沖液重復(fù)清洗膠塊10次；加入含XbaⅠ內(nèi)切酶的酶切混合液，37℃水浴孵育2h后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳；電泳結(jié)束后，使用GelRed核酸染料染色30min，再脫色20min，放入凝膠成像儀拍照。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用WHONET5.6軟件統(tǒng)計(jì)CRE的耐藥情況；采用SPSS21.0軟件進(jìn)行標(biāo)本類型、菌株種類、科室分布等統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示；應(yīng)用BioNumerics軟件對(duì)PFGE結(jié)果進(jìn)行同源性分析。2結(jié)果2.1標(biāo)本類型CRE來(lái)源的無(wú)菌體液標(biāo)本類型以血液標(biāo)本[55.9%(62/111)]為主，其次為腹水[25.2%(28/111)]、胸腔積液[8.1%(9/111)]、腦脊液[3.6%(4/111)]、盆腔積液[1.8%(2/111)]、膽汁[0.9%(1/111)]、腹腔引流液[0.9%(1/111)]、髂窩引流液[0.9%(1/111)]，以及其他無(wú)菌體液[2.7%(3/111)]。2.2菌株的種類111株CRE菌株中，檢出率位于前3位的分別是肺炎克雷伯菌[82.0%(91/111)]、大腸埃希菌[10.8%(12/111)]、產(chǎn)酸克雷伯菌[3.6%(4/111)]，其余檢出的細(xì)菌有臭鼻克雷伯菌[1.8%(2/111)]、產(chǎn)氣腸桿菌[0.9%(1/111)]、陰溝腸桿菌[0.9%(1/111)]。2.3菌株的科室來(lái)源CRE來(lái)源的科室分布中，肝膽外科分離出來(lái)的CRE最多，其次為重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)、血液內(nèi)科、呼吸內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)病房(RICU)、泌尿外科，見(jiàn)表1。表1菌株的科室來(lái)源2.4藥敏結(jié)果CRE對(duì)大多數(shù)抗菌藥物耐藥，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率較高，多高達(dá)100.0%；對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、復(fù)方磺胺甲噁唑、氯霉素耐藥率較低，分別為85.3%、80.0%、87.2%，見(jiàn)表2。表2CRE對(duì)抗菌藥物的耐藥率2.5菌株的碳青霉烯酶表型和基因型分布碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)CRE的碳青霉烯酶表型，結(jié)果顯示,肺炎克雷伯菌主要攜帶絲氨酸酶，大腸埃希菌主要攜帶金屬酶。膠體金免疫層析試驗(yàn)檢測(cè)CRE攜帶碳青霉烯酶類型，結(jié)果顯示，108株(97.3%)攜帶碳青霉烯酶，其中94株(84.7%)攜帶KPC碳青霉烯酶，13株(11.7%)攜帶NDM碳青霉烯酶，1株攜帶IMP碳青霉烯酶，1株同時(shí)攜帶IMP和NDM碳青霉烯酶，未檢測(cè)出OXA-48、VIM碳青霉烯酶；肺炎克雷伯菌主要攜帶KPC碳青霉烯酶[96.7%(88/91)]，大腸埃希菌主要攜帶NDM碳青霉烯酶[83.4%(10/12)]，見(jiàn)表3、表4。表3碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果[n(%)]表4膠體金免疫層析試驗(yàn)2.6菌株的同源性分析將PFGE條帶圖譜進(jìn)行分析，并將具有85%相似度的菌株判定為同一型，具體分型標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[8]：兩菌株條帶的大小數(shù)目完全相同表示是同一菌株；有1～3條條帶不同表示屬于不同亞型；4～6條條帶不同表示可能相關(guān)，7條及以上條帶不同表示不相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，91株肺炎克雷伯菌可分為A～O15個(gè)型，其中A型62株，除PICU、門(mén)診、康復(fù)科未發(fā)現(xiàn)A型菌株外，其余科室均檢出該種菌株，時(shí)間為2019年6月至2021年6月；B型有8株，主要集中在肝膽外科，ICU和腎內(nèi)科各有1株，檢出時(shí)間為2020年11月至2021年1月，見(jiàn)圖1。其他型別菌株數(shù)量較少，呈散在分布。聚類分析圖分析結(jié)果顯示，肝膽外科病區(qū)分離出來(lái)的菌株主要有5型，A型25株(71.4%)，B型6株(17.1%)，C型1株(2.9%)，D型2株(5.7%)，G型1株(2.9%)。ICU分離出來(lái)的菌株有6型，其中A型14株(58.3%)，E型3株(14.3%)，B型、D型、K型、M型各1株。血液內(nèi)科檢出CRE有兩種型別，其中A型6株，N型1株，其余各科室呈散在分布。注：M為質(zhì)控菌株沙門(mén)菌H9812；8470、8363、8409、8314、8246、8217、8313、8305、8285、8283、8273為本實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌編號(hào)。圖1部分CRE的PFGE電泳圖3討論CRE是引起嚴(yán)重感染的重要病原體，如血流感染、肺部感染、復(fù)雜的腹腔感染等[9]。據(jù)2020年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)結(jié)果顯示，2005-2018年，腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率持續(xù)上升，尤其是肺炎克雷伯菌，對(duì)美羅培南的耐藥率更是從2.9%上升至26.3%，近2年雖有所下降，但仍處于較高水平[10]，CRE治療難度大，病死率高，嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生安全[11]。CRE被定義為對(duì)任意一種碳青霉烯類藥物耐藥或者攜帶碳青霉烯酶的一類腸桿菌科細(xì)菌[12]。因?qū)嶒?yàn)條件限制，本研究2019年6月至2020年9月未做厄他培南藥敏試驗(yàn)，因此CRE檢出率可能比實(shí)際偏低。本研究中CRE主要來(lái)源于血液標(biāo)本，其次為腹水、胸腔積液等無(wú)菌體液標(biāo)本，與楊玉琪等[13]結(jié)果相似。CRE的菌株類型主要為肺炎克雷伯菌，其次為大腸埃希菌，其余菌株較少，與郭普等[14]研究結(jié)果符合?；颊吣挲g大、住院時(shí)間長(zhǎng)、有基礎(chǔ)疾病尤其是心臟及肺部疾病，以及長(zhǎng)期使用廣譜抗菌藥物、接受過(guò)有創(chuàng)操作、使用過(guò)免疫抑制劑等都是感染CRE的危險(xiǎn)因素[15-17]。本研究中的CRE主要來(lái)源于肝膽外科，可能與肝膽外科患者肝功能較差，以及肝移植患者服用免疫抑制劑，導(dǎo)致機(jī)體免疫力低有關(guān)。CRE檢出較多的科室其次為ICU，可能與ICU患者病情普遍較重、住院時(shí)間長(zhǎng)、廣譜抗菌藥物使用多、相對(duì)其他科室有創(chuàng)操作較多等因素有關(guān)。本研究中CRE耐藥情況嚴(yán)重，對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、復(fù)方磺胺甲噁唑、氯霉素耐藥率較低，臨床醫(yī)生可根據(jù)藥敏結(jié)果合理用藥。目前，治療CRE的藥物有限，最常用的有多黏菌素和替加環(huán)素，但它們有較大的毒性，并且可能使耐藥性增加[18]。更嚴(yán)重的是，2018年我國(guó)報(bào)道了一種對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物、多黏菌素、替加環(huán)素都耐藥的CRE菌株，這種菌株的出現(xiàn)，使CRE的感染無(wú)藥可用，大大增加了CRE治療的難度[19]。CRE可以通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生耐藥，但最主要的機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，尤其是在我國(guó)，約90%的CRE攜帶產(chǎn)碳青霉烯酶基因[20]。有研究表明，患者感染產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE病死率高于感染其他類型的CRE[21]。因此，需要重點(diǎn)關(guān)注CRE菌株攜帶碳青霉烯酶情況。碳青霉烯酶按Ambler分類可分為A、B和D類3類，A類和D類為絲氨酸酶，B類為金屬酶。其中A類絲氨酸酶KPC是世界范圍內(nèi)最流行的碳青霉烯酶[22]。NDM是流行程度僅次于KPC的碳青霉烯酶，于2009年在肺炎克雷伯菌中被分離出來(lái)[23]。我國(guó)檢出最多的碳青霉烯酶為KPC，其次為NDM，部分地區(qū)有少量IMP、VIM、OXA-48等產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的報(bào)道[23-24]。有研究證明，頭孢他啶-阿維巴坦對(duì)產(chǎn)KPC和OXA-48型絲氨酸酶的菌株有較高抗菌活性，但對(duì)產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶的菌株無(wú)抗菌活性[25]，而B(niǎo)類金屬-β-內(nèi)酰胺酶往往對(duì)氨曲南敏感，因此氨曲南/阿維巴坦復(fù)方制劑常用于由產(chǎn)金屬酶的CRE引起的嚴(yán)重感染[26]。本研究中97.3%的CRE菌株攜帶碳青霉烯酶，高于ZHANG等[20]的研究結(jié)果，這可能與本研究中標(biāo)本排除了痰液、尿液、糞便等非無(wú)菌體液標(biāo)本有關(guān)，也可能與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量少有關(guān)；其余CRE菌株未檢測(cè)到碳青霉烯酶，可能存在其他耐藥機(jī)制，如合并其他β-內(nèi)酰胺酶高表達(dá)(AmpC酶和ESBL酶)或者膜孔蛋白缺失等，需要后期進(jìn)一步研究。碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)CRE產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬-β-內(nèi)酰胺酶表型的方法。任艷麗等[27]將128株CRE碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)的結(jié)果通過(guò)基因檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果完全符合。本研究結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌主要攜帶絲氨酸酶，大腸埃希菌主要攜帶金屬酶。膠體金免疫層析是一項(xiàng)可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)CRE攜帶碳青霉烯酶類型的技術(shù)，對(duì)臨床感染CRE患者尤其是重癥患者早期檢測(cè)CRE產(chǎn)碳青霉烯酶類型并針對(duì)性用藥十分重要[7]。有研究表明，相對(duì)于經(jīng)典的PCR檢測(cè)方法，免疫膠體金技術(shù)的靈敏度及特異度高達(dá)100%[28]。此外，本研究結(jié)果顯示，97.3%的CRE菌株攜帶碳青霉烯酶，主要為KPC，其次為NDM，其中96.7%的肺炎克雷伯菌攜帶KPC，83.4%的大腸埃希菌攜帶NDM，與任艷麗等[27]研究結(jié)果相似。本研究中有2株CRE菌株表型試驗(yàn)為絲氨酸酶陽(yáng)性但膠體金免疫層析法未檢測(cè)到碳青霉烯酶，可能與膠體金免疫層析法只能檢測(cè)KPC、NDM、IMP、VIM、OXA-48共5種常見(jiàn)碳青霉烯酶而無(wú)法檢測(cè)其他罕見(jiàn)的碳青霉烯酶有關(guān)。表型檢測(cè)和膠體免疫層析法結(jié)果不符合的需要后期進(jìn)一步采用PCR擴(kuò)增其他罕見(jiàn)基因來(lái)驗(yàn)證。本研究中91株肺炎克雷伯菌可分共15個(gè)型。其中A型菌株數(shù)量最多，分布科室最廣，表明A型菌株是院內(nèi)最主要的流行菌株。B型菌株共8株，但檢出時(shí)間僅在連續(xù)的3個(gè)