疫苗制備工藝課件

制藥工藝學(xué)PharmaceuticalTechnology制藥工藝學(xué)PharmaceuticalTechnolog疫苗制備工藝第一節(jié)疫苗概述第二節(jié)疫苗制備主要技術(shù)第三節(jié)細(xì)菌性疫苗制備工藝第四節(jié)病毒性疫苗制備工藝疫苗制備工藝第一節(jié)疫苗概述第一節(jié)疫苗概述一、疫苗概念二、疫苗的組成三、疫苗的發(fā)展四、疫苗制備的基本過(guò)程概述疫苗制備第一節(jié)疫苗概述一、疫苗概念概述疫苗制備1、疫苗(Vaccine）的概念類預(yù)防類生物制品；通過(guò)免疫機(jī)制預(yù)防疾病概念：通過(guò)注射或黏膜或口服接種，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)特定病原體的特異性抗體或細(xì)胞免疫，獲得保護(hù)或消滅治療該病原體的能力。特殊性：用于健康人群，嬰幼兒和兒童為主要求：絕對(duì)安全概述疫苗制備1、疫苗(Vaccine）的概念類預(yù)防類生物制品；通過(guò)免疫機(jī)疫苗的分類概述疫苗制備疫苗的分類概述疫苗制備組分疫苗是用單一組分制備的疫苗。類毒素疫苗：用喪失毒性而保留免疫原性的毒素所制成的疫苗，如白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素亞單位疫苗：病原微生物的表面抗原成分制成的疫苗，如乙肝表面抗原疫苗。脂多糖疫苗：胰蛋白酶水解傷寒桿菌制備。優(yōu)點(diǎn)：減少了機(jī)體的反應(yīng)缺點(diǎn)：分子量小，抗原性弱，要加入佐劑，增強(qiáng)免疫效果。概述疫苗制備組分疫苗是用單一組分制備的疫苗。概述疫苗制備聯(lián)合疫苗能預(yù)防多種疾病的聯(lián)合制劑，不同抗原進(jìn)行物理混合后制成。多聯(lián)疫苗：用于預(yù)防不同病原體引起的疾病，如白百破聯(lián)合疫苗。多價(jià)疫苗：用于同一病原體的不同菌株或不同血清型引起的同一疾病，如肺炎多糖疫苗，由23種不同血清型的細(xì)菌多糖組成，只能預(yù)防肺炎鏈球菌。特點(diǎn)：多種免疫原性和穩(wěn)定性的抗原，接種途徑簡(jiǎn)便，一次接種產(chǎn)生多種疫苗肺炎。結(jié)合疫苗是化學(xué)方法將兩種以上抗原相互偶合制成的疫苗概述疫苗制備聯(lián)合疫苗能預(yù)防多種疾病的聯(lián)合制劑，不同抗原進(jìn)行物理混合后制成二、疫苗的組成1）抗原：減活或滅活的病毒或細(xì)菌、或提取物、有效成分等。2）佐劑：能特異性地與抗原結(jié)合，增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)，無(wú)毒安全。金屬鹽類，鋁佐劑和油制佐劑。如Al(OH)3，弗氏佐劑。3）防腐劑：防止外來(lái)微生物污染。硫柳汞、2-苯氧乙醇、氯仿等。4）穩(wěn)定劑：乳糖、明膠、山梨醇等。5）滅活劑：丙酮、酚、甲醛等。6）其他成分：緩沖液、鹽等。概述疫苗制備二、疫苗的組成1）抗原：減活或滅活的病毒或細(xì)菌、或提取物、有三、疫苗發(fā)展簡(jiǎn)史1721:英國(guó)醫(yī)師EdwardJenner，感染牛痘的人不會(huì)再感染天花。1796:Jenner，將擠奶員手上的牛痘潰瘍接種8歲男孩手臂，未感染天花。疫苗接種開(kāi)始。1798：醫(yī)學(xué)界正式接受疫苗預(yù)防疾病。1884：Pastuer，第一個(gè)病毒減活疫苗—狂犬病疫苗。1885：Ferran，霍亂肉湯培養(yǎng)物，開(kāi)始疫苗的注射。1870：Pasteur，第一個(gè)細(xì)菌減活疫苗——雞霍亂疫苗1897：Wright制成傷寒全菌苗。概述疫苗制備三、疫苗發(fā)展簡(jiǎn)史1721:英國(guó)醫(yī)師EdwardJenne三、疫苗發(fā)展簡(jiǎn)史1901：vonBehring，發(fā)現(xiàn)白喉毒素，獲得諾貝爾獎(jiǎng)。1909：Calmetee和Guerin在甘油膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基上，傳代230代，制成減毒活疫苗，即卡介苗。1955：脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗生產(chǎn)。1986：重組乙肝疫苗生產(chǎn)。1990：B型流感嗜血桿菌疫苗，多糖結(jié)合疫苗生產(chǎn)。1995：水痘疫苗、無(wú)細(xì)胞型百日咳疫苗生產(chǎn)。2000：結(jié)核肺炎球菌疫苗生產(chǎn)。概述疫苗制備三、疫苗發(fā)展簡(jiǎn)史1901：vonBehring，發(fā)現(xiàn)白喉四、疫苗制備的基本過(guò)程概述疫苗制備對(duì)菌毒株進(jìn)行優(yōu)化和篩選，建立合格完善的毒種庫(kù)制備的疫苗需進(jìn)行生化和免疫及安全性檢定或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，確定其安全性和免疫原性。疫苗制備的生產(chǎn)人員、廠房、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其他條件要嚴(yán)格遵循GMP的要求和管理。在完全控制條件下，進(jìn)行菌體或細(xì)胞培養(yǎng)，合成抗原。收集菌體或細(xì)胞，破碎、過(guò)濾、色譜等制備抗原加入適當(dāng)?shù)淖魟┗蛏砭彌_體系制劑成型。四、疫苗制備的基本過(guò)程概述疫苗制備對(duì)菌毒株進(jìn)行優(yōu)化和篩選，建第二節(jié)疫苗制備的主要技術(shù)滅活技術(shù)減活技術(shù)質(zhì)量控制主要技術(shù)疫苗制備第二節(jié)疫苗制備的主要技術(shù)滅活技術(shù)主要技術(shù)疫苗制備一、滅活技術(shù)滅活是破壞微生物的生物學(xué)活性，使其喪失感染力和致病性，盡可能最大限度保留免疫原性和抗原性。滅活劑：滅活微生物的試劑與化學(xué)物質(zhì)。物理方法，化學(xué)方法滅活技術(shù)疫苗制備一、滅活技術(shù)滅活是破壞微生物的生物學(xué)活性，使其喪失感染力和致一、滅活技術(shù)加熱：使蛋白質(zhì)變性失活，病原體失去傳染能力。菌毒液于水?。?6－60℃），維持1小時(shí)。受熱要均勻，注意不同病原體的耐熱性。如霍亂疫苗、布氏菌制劑、假單胞桿菌疫苗等。紫外線：使核酸形成TT二聚體，失去遺傳功能。最大限度保留了完整抗原性和免疫原性，但滅活程度不完全，有光復(fù)活的可能性，未在實(shí)際中應(yīng)用。滅活技術(shù)疫苗制備物理方法滅活一、滅活技術(shù)加熱：使蛋白質(zhì)變性失活，病原體失去傳染能力。菌毒一、滅活技術(shù)甲醛，β-丙內(nèi)酯，磷酸三丁酯，丙酮，乙烯亞胺，雙乙烯亞胺，戊二醛，硫柳汞。甲醛滅活：破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使核酸烷基化。過(guò)程復(fù)雜，有時(shí)抗原性受到破壞，但病原體仍然存活。在實(shí)際操作中要嚴(yán)格控制各種條件，如溫度、濃度、時(shí)間和pH等，保證疫苗的安全和穩(wěn)定性。甲醛一般濃度為0.2-0.4%?？蓽缁疃喾N病毒和細(xì)菌，乙腦炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒、狂犬病毒、人巨噬病毒、甲肝病毒和HIV等，傷寒桿菌、棒狀桿菌、綠膿桿菌。滅活技術(shù)疫苗制備化學(xué)方法滅活一、滅活技術(shù)甲醛，β-丙內(nèi)酯，磷酸三丁酯，丙酮，乙烯亞胺，雙二、減活技術(shù)減活：使強(qiáng)菌株、毒株轉(zhuǎn)化為弱毒株，殘留毒力達(dá)到隱性感染，但不誘生臨床癥狀的安全有效的程度設(shè)計(jì)上要在毒力和免疫原性之間平衡，殘留毒力達(dá)到安全性和有效性，而不誘發(fā)疾病。毒力與免疫原性具有一定相關(guān)性，毒力越大，免疫原性越強(qiáng)。過(guò)度減毒將導(dǎo)致失去免疫原性。減活技術(shù)疫苗制備體外減活溫敏性突變化學(xué)誘變二、減活技術(shù)減活：使強(qiáng)菌株、毒株轉(zhuǎn)化為弱毒株，殘留毒力達(dá)到隱體外減活技術(shù)體外減活：連續(xù)傳代減活。病毒可在單一宿主中反復(fù)傳代，也可在異源宿主中繁殖連續(xù)傳代登革熱病毒在狗腎或非洲綠猴腎細(xì)胞上系列傳代減毒，達(dá)到人用安全性?？ń槊?，傳代230代，得到一株致病力完全喪失的活菌株。減活技術(shù)疫苗制備體外減活技術(shù)體外減活：連續(xù)傳代減活。病毒可在單一宿主中反復(fù)傳冷適應(yīng)性減活技術(shù)冷適應(yīng)性穩(wěn)定減毒策略：低溫下能生長(zhǎng)，失去毒力，達(dá)到減毒目的。病毒表現(xiàn)型和體內(nèi)減毒定向選擇，連續(xù)或分段培養(yǎng)，低溫下的冷適應(yīng)株或溫度敏感株。流感病毒野毒株適應(yīng)在較低溫度下生長(zhǎng)，使其不能在較高溫度下復(fù)制，來(lái)達(dá)到減毒的目的。如H2N2毒株32℃在雞胚傳20代，在25℃?zhèn)?7代，28℃?zhèn)?代，25℃?zhèn)?2代，獲得了更加減毒的冷適應(yīng)株。呼吸道合胞病毒：低溫下連續(xù)傳代減毒。減活技術(shù)疫苗制備冷適應(yīng)性減活技術(shù)冷適應(yīng)性穩(wěn)定減毒策略：低溫下能生長(zhǎng)，失去毒力冷適應(yīng)性減活技術(shù)溫度敏感性突變：不同溫度下生長(zhǎng)，進(jìn)行篩選用化學(xué)誘變劑處理或從感冒野毒株中篩選，使毒株不能在≥38℃繁殖，而只能在＜37℃復(fù)制，只能在上呼吸道繁殖，以產(chǎn)生抗體，獲得免疫，卻不能在下呼吸道繁殖，以免引起流感癥狀。減活技術(shù)疫苗制備冷適應(yīng)性減活技術(shù)溫度敏感性突變：不同溫度下生長(zhǎng)，進(jìn)行篩選化學(xué)誘變減活技術(shù)化學(xué)誘變策略：對(duì)病原微生物進(jìn)行誘變，獲得突變株。注意減毒不夠或防止反祖現(xiàn)象。營(yíng)養(yǎng)缺陷：傷寒桿菌Ty21a口服減毒活疫苗。減活技術(shù)疫苗制備化學(xué)誘變減活技術(shù)化學(xué)誘變策略：對(duì)病原微生物進(jìn)行誘變，獲得突變基因工程減活技術(shù)基因工程減活：不同類型的突變和減活位點(diǎn)組合，遺傳重組、基因重配?；蛉笔Щ睿簩⑴c毒力有關(guān)的基因刪除，缺失突變，達(dá)到減毒。主要用于DNA病毒，如腺病毒。遺傳重組：強(qiáng)弱毒株之間的基因交換和重組。兩種毒株同時(shí)感染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生基因重配，在子代篩選出重組病毒。對(duì)分節(jié)RNA病毒適合。流感、漢坦、輪狀病毒等。減活技術(shù)疫苗制備基因工程減活技術(shù)基因工程減活：不同類型的突變和減活位點(diǎn)組合，基因工程減活技術(shù)感冒病毒減活：基因重配策略野毒株H3N2與長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)PR8重配，使重配株具有冷適應(yīng)株的特性，HA和NA基因來(lái)自H3N2野毒株，而其余基因節(jié)段來(lái)自PR8毒株野毒株與溫敏株重配，使重配株變成具有溫敏特性，其表面抗原HA和NA基因是野株的；減活技術(shù)疫苗制備基因工程減活技術(shù)感冒病毒減活：基因重配策略減活技術(shù)疫苗制備三、疫苗質(zhì)量控制物理化學(xué)性質(zhì)檢定安全檢定效力檢定質(zhì)量控制疫苗制備三、疫苗質(zhì)量控制物理化學(xué)性質(zhì)檢定質(zhì)量控制疫苗制備1、理化性質(zhì)外觀，真空度、溶解時(shí)間。外觀：液體制劑，無(wú)色透明，無(wú)異物、凝結(jié)快和沉淀物；混懸液制劑，乳白色懸液；凍干制劑，白色、淡黃色疏松體，海綿狀或結(jié)晶狀，無(wú)凍融現(xiàn)象。封口和包裝嚴(yán)格。防腐劑含量：苯酚低于0.5%－0.25%，氯仿低于0.5%,游離甲醛低于0.02%。純度：蛋白質(zhì)疫苗，測(cè)定有效成分含量，計(jì)算比活性。真核產(chǎn)品純度達(dá)98％以上，原核產(chǎn)品純度達(dá)95％。殘留水分測(cè)定，Al(OH)3測(cè)定。質(zhì)量控制疫苗制備1、理化性質(zhì)外觀，真空度、溶解時(shí)間。質(zhì)量控制疫苗制備細(xì)菌、病毒株和主要原材料的檢查：半成品檢查：是否有雜菌或有害物質(zhì)的污染，滅活劑、防腐劑是否過(guò)量，活菌毒處理是否完善。產(chǎn)品檢查：逐批進(jìn)行，無(wú)菌試驗(yàn)，純毒試驗(yàn)，毒性試驗(yàn)，熱源試驗(yàn)，安全性試驗(yàn)等。質(zhì)量控制疫苗制備2、安全性檢定細(xì)菌、病毒株和主要原材料的檢查：質(zhì)量控制疫苗制備2、安全性檢質(zhì)量控制疫苗制備動(dòng)物保護(hù)力（免疫力）試驗(yàn)：免疫動(dòng)物后，再用野生菌或毒株攻擊動(dòng)物，判斷免疫保護(hù)的水平?；钜呙缧Яy(cè)定：細(xì)菌苗以制品中抗原菌的存活數(shù)表示其效力，稀釋菌液，涂布平板，計(jì)數(shù)計(jì)算活菌率％?；畈《疽呙缫圆《镜味缺硎荆?0％細(xì)胞培養(yǎng)法感染量CCID50表示，疫苗稀釋后，接種于傳代細(xì)胞，培養(yǎng)檢測(cè)CCID50。血清學(xué)試驗(yàn)：體外抗原抗體試驗(yàn)、凝集反應(yīng)、中和反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。3、效力檢定質(zhì)量控制疫苗制備動(dòng)物保護(hù)力（免疫力）試驗(yàn)：免疫動(dòng)物后，再用野基本過(guò)程培養(yǎng)方法吸附百白破聯(lián)合疫苗制備細(xì)菌疫苗疫苗制備第三節(jié)細(xì)菌性疫苗制備工藝基本過(guò)程細(xì)菌疫苗疫苗制備第三節(jié)細(xì)菌性疫苗制備工藝細(xì)菌疫苗疫苗制備一、細(xì)菌性疫苗制備的基本過(guò)程減活疫苗細(xì)菌疫苗疫苗制備一、細(xì)菌性疫苗制備的基本過(guò)程減活疫苗二、菌體的培養(yǎng)方法不同細(xì)菌的培養(yǎng)基成分的不同，培養(yǎng)方式基本相同固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)取第一代培養(yǎng)物在大試管中擴(kuò)大培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)種于大克氏瓶（每瓶裝100～120mL瓊脂培養(yǎng)基），經(jīng)培養(yǎng)后刮取菌苔懸于生理鹽水中。滅活疫苗：經(jīng)滅活后，稀釋成一定濃度減活疫苗：不殺菌，加適宜保護(hù)劑后制成，冷凍干燥的劑型。細(xì)菌疫苗疫苗制備二、菌體的培養(yǎng)方法不同細(xì)菌的培養(yǎng)基成分的不同，培養(yǎng)方式基本相1.原液：百日咳疫苗原液，白喉類毒素原液，破傷風(fēng)類毒素原液，氫氧化鋁佐劑2.半成品配方1ml：百日咳桿菌不高于9X109個(gè)菌；白喉類毒素不高于20Lf；破傷風(fēng)類毒素不高于5Lf3.半成品配制：注射水稀釋氫氧化鋁成1-1.5mg/ml，加硫柳汞（不高于0.1g/L），NaCl含量至8.5g/L。按計(jì)算量，將各疫苗原液加入氫氧化鋁稀釋液內(nèi)，pH5.8-7.2，無(wú)菌檢查合格。4.成品：分批、分裝、不同規(guī)格，包裝。成品檢定，保存（2-8度避光，有效期18個(gè)月）細(xì)菌疫苗疫苗制備三、吸附百白破聯(lián)合疫苗制備1.原液：百日咳疫苗原液，白喉類毒素原液，破傷風(fēng)類毒素原液，1菌種：百日咳桿菌（Bordetellapertussis）I相，培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性、皮膚壞死試驗(yàn)、毒力及免疫力試驗(yàn)符合《中國(guó)藥典》要求。細(xì)菌疫苗疫苗制備2.原液制備生產(chǎn)用種子：35-37°C培養(yǎng)不超過(guò)72h,以后各代不超過(guò)48h,傳代菌種保存不超過(guò)14d，工作種子批不超過(guò)10代。百日咳疫苗原液制備工藝1菌種：百日咳桿菌（Bordetellapertussis細(xì)菌疫苗疫苗制備2.原液制備固體培養(yǎng)工藝：活性炭半綜合瓊脂培養(yǎng)基的克氏瓶中48h，不銹鋼刮棒逐瓶收集菌苔至PBS緩沖液（pH7.0-7.4）中。滅活：加入0.1％甲醛，于37℃存放2～3d殺菌；或加入0.04％甲醛處理1～2d后，再以56℃加熱30min。檢驗(yàn)：原液經(jīng)純菌試驗(yàn)和無(wú)菌試驗(yàn)合格后，保存于4～8℃冷庫(kù)，原液需放置3～4個(gè)月，待解毒完全3.檢定：各項(xiàng)指標(biāo)合格后，才可用于配制聯(lián)合疫苗百日咳疫苗原液制備工藝細(xì)菌疫苗疫苗制備2.原液制備百日咳疫苗原液制備工藝白喉類毒素疫苗原液制備工藝1、菌種：白喉?xiàng)U菌PW8株2、生產(chǎn)用種子：工作種子批傳代擴(kuò)大，再傳代到產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管，再傳代到產(chǎn)毒培養(yǎng)基生產(chǎn)用培養(yǎng)基：胰酶牛肉消化3、液體培養(yǎng)，嚴(yán)格控制雜菌，白喉?xiàng)U菌產(chǎn)生毒素4、收獲：過(guò)濾或離心，收獲上清，毒素效價(jià)不低于150Lf/ml[絮狀單位]5、脫毒：用甲醛脫毒6、精制：用硫酸銨、活性炭二段鹽析等方法7、脫毒檢查與檢定：符合藥典規(guī)定細(xì)菌疫苗疫苗制備白喉類毒素疫苗原液制備工藝1、菌種：白喉?xiàng)U菌PW8株細(xì)菌疫苗破傷風(fēng)類毒素疫苗原液制備工藝1、菌種破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌2、生產(chǎn)用種子：工作種子批在產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管中傳代，再傳代到產(chǎn)毒培養(yǎng)基，制成生產(chǎn)用種子

生產(chǎn)用培養(yǎng)基：酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白質(zhì)經(jīng)水解后制備3、液體培養(yǎng)，產(chǎn)生毒素，嚴(yán)格控制雜菌4、收獲：過(guò)濾或離心，收獲上清，毒素效價(jià)不低于40Lf/ml[絮狀單位]5、脫毒：用甲醛在適宜溫度下脫毒，脫毒檢查6、精制：用硫酸銨、超濾、等電沉淀等方法7、原液檢定：符合藥典規(guī)定細(xì)菌疫苗疫苗制備破傷風(fēng)類毒素疫苗原液制備工藝1、菌種破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌細(xì)菌基本過(guò)程甲肝疫苗流感疫苗基因工程乙肝疫苗細(xì)菌疫苗疫苗制備第四節(jié)病毒性疫苗制備工藝基本過(guò)程細(xì)菌疫苗疫苗制備第四節(jié)病毒性疫苗制備工藝病毒疫苗疫苗制備健康動(dòng)物消化組織原代細(xì)胞培養(yǎng)收獲原苗動(dòng)物組織取出病毒懸液純化病毒滅活原苗滅活疫苗毒株毒種培養(yǎng)基制備種子細(xì)胞種子培養(yǎng)放大培養(yǎng)收培養(yǎng)物分離純化加保護(hù)劑精制滅活疫苗接種一、基本制備工藝過(guò)程病毒疫苗疫苗制備健康動(dòng)物消化組織原代細(xì)胞培養(yǎng)收獲原苗動(dòng)物組織二、甲肝疫苗制備工藝病毒疫苗疫苗制備人成纖維二倍體細(xì)胞培養(yǎng)：?jiǎn)螌?，接種毒種再培養(yǎng)3－4周，收獲病毒液，凍融、超聲處理，過(guò)濾，提純，甲醛滅活，Al(OH)3吸附，成品。原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)：接種培養(yǎng)，收獲病毒液，甲醛滅活，過(guò)濾，成品。Vero細(xì)胞培養(yǎng)（歐洲）：Vero單層細(xì)胞，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，收獲后滅活（80％PEG），蔗糖密度梯度超速離心純化，成品。二、甲肝疫苗制備工藝病毒疫苗疫苗制備人成纖維二倍體細(xì)胞培養(yǎng)：三、三價(jià)(H3N2和H1N1亞型及乙型毒株)純化流感疫苗制備疫苗制備雞胚接種流感疫苗毒種收獲培養(yǎng)液超濾和密度區(qū)帶離心透析脫糖33-37℃