解酒養(yǎng)肝散保肝作用及保肝作用機(jī)制研究

解酒養(yǎng)肝散保肝作用及保肝作用機(jī)制研究

急性酒精中毒也被稱為酒精，分為三個(gè)階段：興奮、共濟(jì)失調(diào)和昏迷。酒精在人體內(nèi)的分解代謝途徑主要有三條：肝臟、皮膚和呼吸系統(tǒng)，90%以上酒精通過肝臟的酶系統(tǒng)進(jìn)行氧化代謝解酒養(yǎng)肝散是廣州市海珠區(qū)中醫(yī)醫(yī)院馬哲河主任醫(yī)師三十余年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，臨床用于醒酒療效顯著，具有一定的研發(fā)價(jià)值。本研究擬觀察解酒養(yǎng)肝散的醒酒功效并探討其醒酒機(jī)制及保肝作用機(jī)制。1材料和方法1.1動(dòng)物KM小鼠140只，SPF級，體質(zhì)量18～22g，購于中山大學(xué)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心東校園），許可證號：SCXK（粵）2016-0029。1.2試劑、實(shí)驗(yàn)設(shè)備解酒養(yǎng)肝散中藥樣品由廣州市海珠區(qū)中醫(yī)醫(yī)院提供，批號：20190115，藥物濃度以中藥生藥量計(jì)算。海王牌金樽片，衛(wèi)食健字（2002）第0396號，深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號：20180403。中藥分別給予的劑量為20mL/kg，按體質(zhì)量換算相當(dāng)于60kg成人服用120mL/d的10倍；海王金樽小鼠給予劑量為99mg/kg，按體質(zhì)量換算相當(dāng)于60kg成人每日服用量9g的66倍。北京二鍋頭酒（56℃），保定市大紅門酒業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證：SC11513060700903；氯化鈉，AR級，天津市百世化工有限公司生產(chǎn)，批號：20180428;GSH測試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20190111;T-SOD測試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20190110;MDA測試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20190112;CAT測試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20190114;ADH測試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20190114;ALDH測試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20190119;TP試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號：180761;AST試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號：180811;ALT試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號：180841；三氯乙酸，分析純，廣東光華化學(xué)廠，批號：20070115；石油醚，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號：20150104；無水乙醇，色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20170101；叔丁醇，GC級，上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10085761；有機(jī)系微孔濾膜，0.22μm，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高純氦氣，99.999%，廣氣氣體有限公司。1.3紫外分光光度計(jì)和設(shè)備BS110S電子天平，北京塞多利斯天平有限公司；ACS-1A1電子計(jì)量秤，深圳愛華衡器有限公司生產(chǎn)；YLS-4C轉(zhuǎn)棒式疲勞儀，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司；UV2102-PC可掃描紫外可見光分光光度計(jì)，龍尼柯（上海）儀器有限公司；TG型高速離心機(jī)，上海安亭儀器廠；GS-15R型離心機(jī)，德國BECNIHAN;IKA-T18組織勻漿機(jī)，德國IKA公司；DK-600型水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FAITH-1000型全自動(dòng)生化儀，南京勞拉電子有限公司；Agilent7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；RTX-1701石英毛細(xì)管柱，30m×0.25mm,0.25μm,RESTEK公司。1.4組、藥物組和實(shí)驗(yàn)方法1.4.1模型小鼠造模及數(shù)據(jù)獲取選取健康KM小鼠80只，體質(zhì)量18～22g，雌雄各半，檢疫3d。小鼠先進(jìn)行篩選，將小鼠置于YLS-4C轉(zhuǎn)棒式疲勞儀，以20r/min速度旋轉(zhuǎn)，選取能夠連續(xù)在轉(zhuǎn)棒上行走1min以上不掉下來的即為合格；然后將小鼠隨機(jī)分成6組，分別為模型對照組、蒸餾水對照組、A組、B組、C組和海王金樽對照組，每組不少于10只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食12h，各組小鼠空腹灌胃給予北京二鍋頭酒（56℃）0.15mL/10g，醉酒模型成功表現(xiàn)為翻正反射消失，呆滯昏睡等，實(shí)驗(yàn)中剔除對二鍋頭酒不敏感的小鼠（即實(shí)驗(yàn)過程中均未能翻正反射消失的小鼠）。灌胃給予白酒30min后，A,B,C組小鼠分別灌胃給予藥液0.2mL/10g；海王金樽對照組小鼠灌胃給予劑量為99mg/10g、蒸餾水組灌胃給予蒸餾水0.2mL/10g、模型對照組不予給藥處理。給予二鍋頭白酒后開始計(jì)時(shí)，觀察并記錄造模以及給藥期間小鼠有無死亡、嘔吐、乏力等癥狀，記錄小鼠翻正反射消失時(shí)間和翻正反射恢復(fù)時(shí)間，計(jì)算小鼠醉倒率、醉酒潛伏期和醉酒維持時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并比較組間差異。1.4.2檢測肝臟生化指標(biāo)選取健康KM小鼠60只，體質(zhì)量18～22g，雌性，檢疫3d。小鼠隨機(jī)分成3組，分別為蒸餾水對照組、A組、海王金樽對照組，每組20只。用北京釀酒總廠生產(chǎn)的100mL裝56°紅星二鍋頭0.15mL/10g制備醉酒模型并開始計(jì)時(shí)，30min后給予受試樣品劑量為20mL/kg；每隔1h摘眼球取血，3h內(nèi)共取血3次，室溫靜置后，2000rpm離心，取上清-20℃保存?zhèn)溆?；每小時(shí)小鼠取血后隨機(jī)抽取6～7只小鼠處死并取肝臟，-80℃保存?zhèn)溆?。小鼠血清用全自?dòng)生化分析儀測定血清AST、ALT,TP；肝組織解凍后稱重，制備成10%的勻漿液，3000rpm冷凍離心，上清液經(jīng)全自動(dòng)生化儀測定TP、紫外可見光分光光度計(jì)檢測SOD、ADH、ALDH、MDA、GSH、CAT含量。另取血清0.1mL，加入0.3mL20%三氯乙酸，2.0mL去離子水，漩渦振蕩30s，超聲15min，混勻，3500r/min，離心10min，取上清2.0mL加2.0mL石油醚，漩渦振蕩30s,3500r/min，離心10min，取上清1.0mL過0.22μm有機(jī)系膜，濾液備用。取肝臟0.1g，加入去離子水l.0mL，組織勻漿，3500r/min，離心10min，取上清（勻漿液）0.2mL，加入0.3mL20%三氯乙酸，2.0mL去離子水，漩渦振蕩30s，超聲15min，混勻，3500r/min離心l0min，取上清2.0mL加2.0mL石油醚，漩渦振蕩30s,3500r/min，離心10min，取上清1.0mL過0.22μm有機(jī)系膜，濾液備用。氣相檢測乙醇條件：石英毛細(xì)管柱（Rtx-1701,30m×0.25mm×0.25μm）質(zhì)譜檢測器，柱箱溫度80℃，進(jìn)樣口溫度150℃，檢測器溫度250℃，程序升溫80℃保持10min，分流進(jìn)樣，總流量34.9m/min，分流比50∶1，載氣：氦氣。乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：無水乙醇（色譜純）梯度系列：0、0.5、1.25、2.5、5.0、10.0μL至50mL容量瓶（石油醚定容），叔丁醇內(nèi)標(biāo)800ppm。進(jìn)樣2μL，分離測定，以乙醇濃度對內(nèi)標(biāo)峰面積比乙醇峰面積繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用氣相色譜儀檢測血清和肝組織勻漿液中乙醇濃度變化，各組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，并比較組間差異。1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差2結(jié)果2.1受試樣品a解酒作用與同期模型對照組相比，A組的小鼠醒酒數(shù)明顯增多，醉酒潛伏期延長，醉酒維持時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05、P<0.01），提示受試樣品A具有解酒作用。結(jié)果見表1。2.2勻漿和肝勻漿的抗氧化檢測三種受試樣品的解酒實(shí)驗(yàn)完成后，A組的作用效果最佳，采用A樣進(jìn)行醒酒機(jī)制及保肝實(shí)驗(yàn)，小鼠血清生化指標(biāo)的檢測結(jié)果見表2；肝勻漿液的ADH和ALDH結(jié)果表3；肝勻漿液的抗氧化指標(biāo)檢測結(jié)果見表4；采用GC-MS檢測血清和肝勻漿液中乙醇濃度結(jié)果見表5。與同期蒸餾水組相比，A組不同時(shí)間的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平降低，能夠明顯提高小鼠體內(nèi)的ADH和ALDH水平，降低小鼠肝組織的MDA水平，提高SOD和CAT水平，不同時(shí)間段降低醉酒小鼠的血清和肝組織乙醇含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3社會(huì)熱邪為熱，肝有熱邪乙醇絕大部分在肝內(nèi)代謝，ADH和A