LI-COROdyssey紅外熒光掃描成像

Odyssey學(xué)高分子物質(zhì)〔膜、膠、微孔塑料板等〕也會(huì)發(fā)出熒光，因此易產(chǎn)生高背景的熒LI-COROdyssey承受22680nm780nm2720nm820nm的放射熒光，因而OdysseyIRDyes染料的熒光信號(hào)。IRDyes染料的最大吸取值與Odyssey680nm780nm激發(fā)波長(zhǎng)相匹配，其放射光波長(zhǎng)又與OdysseyIRDye700IRDye800100nm，因此Odyssey可以給出最大的靈敏度和最小的信號(hào)穿插。同時(shí)由于承受二極管激光器和固態(tài)檢測(cè)器，Odyssey具有很長(zhǎng)的使用壽命〔4-6萬(wàn)小時(shí)，而系統(tǒng)維護(hù)的要求卻很低。該In-Cell-Western分析等蛋白領(lǐng)域爭(zhēng)論。主要特點(diǎn)X廢料產(chǎn)生。3．雙色檢測(cè)，可以在一次雜交中同時(shí)檢測(cè)兩種目的分子，直觀，省時(shí)。寬廣的線性范圍，可用于高準(zhǔn)確性定量。背景低，圖像清楚，激光強(qiáng)度可調(diào)，不會(huì)喪失弱的信號(hào)強(qiáng)有力的軟件支持，結(jié)果分析如確定分子量和定量及圖象處理編輯很簡(jiǎn)潔系統(tǒng)操作和維護(hù)簡(jiǎn)潔Odyssey的應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域：蛋白質(zhì)爭(zhēng)論，核酸爭(zhēng)論分析，考馬司亮蘭膠的掃描，蛋白雙向電泳，雙色EMSA，雙色微孔板分析，BDPowerBlotAnalysis，NorthernBlot，SouthernBlot等二．系統(tǒng)安裝條件位置要求：穩(wěn)定水平的操作平臺(tái)放置設(shè)備，遠(yuǎn)離熱源，避開(kāi)陽(yáng)光直射空間及載重要求：操作平臺(tái)尺寸〔長(zhǎng)×寬×高操作平臺(tái)載重：40kg3.：15-25℃4.濕度要求：不超過(guò)60%5.：90-250VAC，47-63Hz。6.其它：通用插頭接線板〔3〕`三．培訓(xùn)所需試劑設(shè)備及樣品WesternBlot：western細(xì)胞裂解液電泳緩沖液轉(zhuǎn)移緩沖液PBSTBSTween-20一抗錫箔紙〔通用試劑具體配方請(qǐng)參照《分子克隆試驗(yàn)指南〕其它配套設(shè)備：蛋白電泳儀脫色搖床轉(zhuǎn)膜儀分子生物學(xué)試驗(yàn)室常用工具：加樣器，Tip頭，量筒，離心管，離心機(jī)，冰盒等。作。四、培訓(xùn)程序準(zhǔn)時(shí)間安排〔請(qǐng)至少安排2〕儀器安裝及使用培訓(xùn)〔2小時(shí)〕試驗(yàn)安排布置，用戶實(shí)際操作培訓(xùn)〔不同的試驗(yàn)時(shí)間有所不同，以WesternBlot1天半光檢測(cè)的比照試驗(yàn)，便利兩種方法結(jié)果的比照。軟件根本功能綜述及使用培訓(xùn)〔1小時(shí)〕五、儀器及試劑系統(tǒng)介紹Odyssey紅外成像系統(tǒng)技術(shù)特點(diǎn)講解儀器系統(tǒng)組成和工作原理講解配套試劑介紹試驗(yàn)設(shè)計(jì)：化學(xué)發(fā)光及熒光檢測(cè)比照試驗(yàn)4marker未稀釋樣品，1：10，1：100，1：1000，預(yù)染marker，未稀釋樣品，1：10，1：100，1：1000〔兩組樣品中間建議空一個(gè)樣品孔，便利以后的剪膜〕轉(zhuǎn)膜完成后，開(kāi)頭進(jìn)展封閉及一抗孵育的操作步驟學(xué)發(fā)光檢測(cè)的方式進(jìn)展二抗的孵育，洗脫及結(jié)果的分析。Western的試驗(yàn)流程可Western試驗(yàn)室的方法。熒光檢測(cè)Western操作流程〔以硝酸纖維素膜為例：吸去培育液，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次參加細(xì)胞裂解液，420min1.5ml離心管，13000rpm，4℃，20min取上清蛋白進(jìn)展電泳硝酸纖維素膜于轉(zhuǎn)移緩沖液〔PBS〕20min〔PVDF膜，請(qǐng)先20min〕20min。裁兩張與膠同樣大小的濾紙,置轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。30min。1～3hour。注：封閉液可以用5的進(jìn)口脫脂奶粉〔用PBS溶解，由于Tween-20和BSAOdyssey造成高背景，所以在封閉完成前盡量不要讓膜接觸到這兩種物質(zhì)，所以麻煩您確定封閉液中沒(méi)有Tween-20BSA成分?！?1000－150001hour或者4℃過(guò)夜。注：抗體的稀釋倍數(shù)與抗體質(zhì)量和試驗(yàn)中的蛋白樣本相關(guān)，麻煩您依據(jù)閱歷選擇適宜稀0.1-0.2%的Tween-20來(lái)降低背景，您可以依據(jù)您要檢測(cè)的蛋白以及尋常操作閱歷來(lái)選擇需否在一抗稀釋液。PBST4×5mins?！?3000~100001hour〔避光。0.1-0.2%Tween-20Tween-20。Tween-200.01-0.02%SDS于二抗稀釋液中可以比較好的降低背景洗膜同13〔避光〕PBSTween-20，接下來(lái)可直接進(jìn)展掃描。試驗(yàn)的具體的操作流程、留意事項(xiàng)、問(wèn)題解決請(qǐng)參見(jiàn)附件以及《分子克隆試驗(yàn)。儀器的操作流程：在面板上翻開(kāi)儀器電源開(kāi)關(guān)，再開(kāi)啟電腦，關(guān)機(jī)時(shí)相反。用軟布或無(wú)塵紙蘸雙蒸水將掃描平面的玻璃擦拭干凈。將要掃描的膠或膜放到掃描平面上，登記坐標(biāo)，扣上艙蓋。雙擊軟件圖標(biāo)，輸入用戶名、密碼，進(jìn)入主菜單。點(diǎn)擊scan開(kāi)頭掃描。掃描完畢后對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)展分析。依次進(jìn)展圖象裁切、定道、定分子量標(biāo)準(zhǔn)、背景扣除等操作。依據(jù)需要輸出圖形或數(shù)據(jù)報(bào)告表格。速把握如何使用軟件進(jìn)展掃描。關(guān)于進(jìn)一步的如何使用軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)展分析，請(qǐng)參見(jiàn)隨機(jī)所帶的英文原版使用手冊(cè)。掃描操作流程中添加內(nèi)容，則點(diǎn)擊“Fil”欄中的“Ope〕在窗口“NewProject”中設(shè)定工程文件存儲(chǔ)的路徑和工程名稱(chēng)在登陸窗口輸入用戶名和密碼在“Name”欄輸入該次掃描的名稱(chēng)在“Group”欄選擇用戶所屬的組在“Preset”欄選擇目前進(jìn)展掃描的介質(zhì)〔eg：膜還是膠？〕選擇適宜的區(qū)分率，掃描質(zhì)量和焦距〔對(duì)于膜來(lái)說(shuō)，一般選擇區(qū)分率為169，medium01/2〕700800或兩者皆選，每個(gè)通道的激光強(qiáng)度可分別在“Intensity”欄調(diào)整色矩形框，使其將膜的區(qū)域完全掩蓋〔留意：膜或膠一般均放置在掃描平面的左下方?？凵吓撋w開(kāi)頭掃描和靈敏度，調(diào)整好后點(diǎn)擊“OK”按鈕確認(rèn)NameOriginalAnalysis，點(diǎn)擊“OK”將未做更改的原始圖片保存如何中止掃描要提前中止掃描過(guò)程，可以點(diǎn)擊掃描掌握窗口中的“Stop”按鈕或者連續(xù)按兩次掃描儀面板上的“Stop”鍵，此時(shí)掃描圖像文件會(huì)被關(guān)閉并被保存下來(lái)，假設(shè)八.常見(jiàn)問(wèn)題處理問(wèn)題：高背景，但是是均勻分布的可能緣由封閉液中有Tween-20封閉液中有BSA沒(méi)有使用最正確的封閉試劑硝酸纖維素膜上的背景PVDF抗體濃度太高洗膜不徹底反響使用的抗體量不適宜膜的污染問(wèn)題：背景上有不均勻的斑點(diǎn)分布可能緣由封閉液中同時(shí)處理了多張膜PonceauS膜沒(méi)有始終保持潮濕，局部被吹干使用的鑷子和容器被污染

建議在封閉完成前不要讓膜接觸到Tween-20永久不要將BSABSA不行逆的高背景對(duì)不同的封閉液進(jìn)展比較找到最適合自己體系的封閉液；另外可以延長(zhǎng)封閉時(shí)間在稀釋的抗體中參加 Tween-20從而降低背景。Tween-20的濃度需要依據(jù)所用的一抗進(jìn)展優(yōu)化一般為0.05-1%削減或者除去稀釋抗體中的Tween-2牛奶作為封閉液的時(shí)候優(yōu)化一抗和二抗的稀釋倍數(shù)增加洗膜次數(shù)和洗膜液的量0.1%Tween-20,必要時(shí)可提高Tween-20，過(guò)量的Tween-20(0.5-1%)可能會(huì)使信號(hào)減弱。OdysseyIgG,IgG增加抗體的量，使膜完全浸沒(méi)其中。建議量能夠使全部的膜都能接觸到溶液同時(shí)移動(dòng)自如。PonceauSPonceauS使膜的背景增高這一點(diǎn)格外重要。假設(shè)使用PVDF100%甲醇浸濕。。臟的鑷子會(huì)將染料帶到膜上，無(wú)法洗脫。孵育時(shí)使用干凈的鑷子和容器問(wèn)題：信號(hào)微弱或者沒(méi)有信號(hào)可能緣由蛋白沒(méi)有成功從膠中轉(zhuǎn)移出來(lái)檢測(cè)過(guò)程中蛋白從膜上喪失使用的抗原量缺乏使用了錯(cuò)誤的封閉液轉(zhuǎn)移過(guò)程中蛋白沒(méi)有保存在膜上

建議正確Odysseymarker對(duì)膠進(jìn)展染色以確定沒(méi)有蛋白留在膠中過(guò)長(zhǎng)的封閉時(shí)間或者抗體稀釋液中高濃度的Tween-20〔0.5-1%〕會(huì)導(dǎo)致膜上抗原局部喪失抗原。Odyssey液。使蛋白結(jié)合得更為結(jié)實(shí)。膜時(shí)的“三明治”中間是否有氣泡?！膊煌目乖そY(jié)合的力量不同〕在轉(zhuǎn)移液中添加20%的甲醇會(huì)有助于抗原同膜的結(jié)合〔成阻礙〕轉(zhuǎn)移液中的SDS備是那些低分子量的蛋白SS注使用的抗體量缺乏膜的類(lèi)型不適宜

0.5SDS提高轉(zhuǎn)移效率?；蛘呖s短轉(zhuǎn)移時(shí)間。適合的濃度。延長(zhǎng)一抗得孵育時(shí)間〔室溫下4-8小時(shí)或者4℃過(guò)夜。增加二抗的量，優(yōu)化出最適合的濃度。由于放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者保存不當(dāng)抗體失去作用；用dotblotPVDF膜靈敏度更高。問(wèn)題：消滅非特異性或者非預(yù)期的條帶可能緣由抗體