控制菌及螨類檢查技術(shù)-藥品中金黃色葡萄球菌檢查

項(xiàng)目九控制菌檢查及螨類檢查技術(shù)任務(wù)8藥品中金黃色葡萄球菌檢查技能點(diǎn)4血漿凝固酶試驗(yàn)操作1.實(shí)訓(xùn)目的掌握血漿凝固酶試驗(yàn)操作程序及注意事項(xiàng)。2.實(shí)訓(xùn)要求2.1能按下達(dá)的任務(wù)要求，完成血漿凝固酶檢查的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。2.2能根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)完成試驗(yàn)的準(zhǔn)備及試驗(yàn)的具體操作。2.3能根據(jù)試驗(yàn)反應(yīng)的結(jié)果做出正確的結(jié)論。

3.實(shí)驗(yàn)原理

血漿凝固酶是指能使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的人或兔的血漿發(fā)生凝固的酶類物質(zhì)。致病性葡萄球菌大多能產(chǎn)生凝固酶，非致病葡萄球菌不產(chǎn)生此酶。血漿凝固酶是鑒別葡萄球菌有無(wú)致病性的重要指標(biāo)。血漿凝固酶試驗(yàn)操作4.實(shí)驗(yàn)材料

菌種：金黃色葡萄球菌（SA）、表皮葡萄球菌（SE）、兔血漿、生理鹽水（備用）玻片

5.實(shí)驗(yàn)操作

取無(wú)菌試管(10mm×100mm)3支，各加入血漿和0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(1：1)0.5ml。其中1支加入瓊脂斜面培養(yǎng)物菌懸液(或被檢菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液)0.5ml。其余2支作對(duì)照管:1支加入金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]菌懸液和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5ml作為陽(yáng)性對(duì)照；另1支加入營(yíng)養(yǎng)肉湯和0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對(duì)照。3管同時(shí)置36℃±1℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱,3h后開(kāi)始檢查，以后每隔適當(dāng)時(shí)間觀察一次，直至24h。檢查時(shí)，輕輕將試管傾斜(動(dòng)作勿大)，仔細(xì)觀察，陰性對(duì)照管血漿流動(dòng)自如，陽(yáng)性對(duì)照管液呈凝固狀，試驗(yàn)管液呈凝固狀者為陽(yáng)性反應(yīng)；不凝固為陰性反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管任何一管不符合要求時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。

血漿凝固酶試驗(yàn)操作6.結(jié)果判斷

如果革蘭氏染色結(jié)果清晰可靠（必要時(shí)加做已知革蘭染色結(jié)果的細(xì)菌進(jìn)行染色質(zhì)量控制），凝固酶試驗(yàn)陰性對(duì)照試驗(yàn)為陰性，陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果，供試品培養(yǎng)物按下列情況報(bào)告或處理。6.1疑似菌革蘭染色呈陽(yáng)性球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)者，報(bào)告1g或1ml供試品檢出金黃色葡萄球菌(少許菌株可能不是金黃色葡萄球菌而是葡萄球菌屬的其他菌種）6.2革蘭染色鏡檢不是革蘭陽(yáng)性球菌，成血漿凝固酶試驗(yàn)陰性反應(yīng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。6.3陰性對(duì)照試驗(yàn)有菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。6.4陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性結(jié)果，應(yīng)當(dāng)加做驗(yàn)證試驗(yàn)，考察檢品是否有抑菌性。血漿凝固酶試驗(yàn)操作7.注意事項(xiàng)7.1金黃色葡萄球菌在上述兩種分離培養(yǎng)基上的典型菌落為金黃色。但由于受藥物影響成非典型菌體存在，亦可呈橙黃色、檸檬色或白色。做控制菌檢查，對(duì)非典型菌落也有必要進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)做金黃色葡萄球菌的篩查，以防漏檢金黃色葡萄球菌。培養(yǎng)基存放時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間影響色素產(chǎn)生，故培養(yǎng)基應(yīng)新鮮配制。培養(yǎng)時(shí)間宜48h以上。7.2如果使用干燥培養(yǎng)基，應(yīng)按說(shuō)明書(shū)配制，注意pH是否符合規(guī)定，必要時(shí)應(yīng)校正pH后滅菌使用7.3血漿凝固酶試驗(yàn)應(yīng)用新鮮培養(yǎng)物及新鮮血漿。如用陳舊培養(yǎng)物及血漿(纖維蛋白常析出)易導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。此外，觀察結(jié)果時(shí)不要搖動(dòng)試管，因凝固初期凝塊易破壞，引起假陰性試驗(yàn)。血漿凝固酶試驗(yàn)操作項(xiàng)目九控制菌檢查及螨類檢查技術(shù)任務(wù)8藥品中金黃色葡萄球菌檢查知識(shí)點(diǎn)8藥品中金黃色葡萄球菌檢查方法8.1金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌為葡萄球菌屬中的一種，廣泛分布于自然界空氣、土壤、水及物品上，人和動(dòng)物皮膚及與外界相通的腔道中也經(jīng)常有本菌存在。本菌可產(chǎn)生多種毒素及酶，這些毒性物質(zhì)能引起局部及全身化膿性炎癥，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展成為敗血癥和膿毒血癥，是人類化膿性感染中重要的病原菌。

金黃色葡萄球菌檢查按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢和血漿凝固酶試驗(yàn)等步驟進(jìn)行。本法適用于外用藥品及一般滴眼劑、眼膏劑的檢查。8.1.1形態(tài)特征

金黃色葡萄球菌菌體呈球形,直徑0.5-1.5μm,平均直徑0.8μm,菌體大小均勻一致.無(wú)鞭毛和芽孢,除及少數(shù)菌株外一般不形成莢膜。金黃色葡萄球菌菌體易被堿性染料著色，因此革蘭染色呈陽(yáng)性，但已衰老，死亡的菌體由于核酸含量降低等原因，被中性粒細(xì)胞吞噬后的菌體堿性染料就不易著色了，常呈革蘭染色陰性。藥品中金黃色葡萄球菌檢查方法8.1.2培養(yǎng)特征

金黃色葡萄球菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求不高，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適生長(zhǎng)pH為7.4，該菌耐鹽性極強(qiáng)，在含有10%-15%氯化鈉的培養(yǎng)基中仍可生長(zhǎng)繁殖，可用于金黃色葡萄球菌的分離。金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生脂溶性的金黃色色素，不溶于水，因此菌落著色，培養(yǎng)基不著色。本菌含有卵磷脂酶，可將卵磷脂分解而使菌落出現(xiàn)乳濁圈。8.1.3生化反應(yīng)

金黃色葡萄球菌的生化活性很強(qiáng)，能分解萄葡糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等多種糖類，乳酸為其最終代謝產(chǎn)物，但不產(chǎn)氣體；該菌甲基紅反應(yīng)和VP試驗(yàn)為+；靛基質(zhì)試驗(yàn)-；尿素酶試驗(yàn)+；硝酸鹽還原試驗(yàn)+；明膠液化試驗(yàn)+；甘露醇試驗(yàn)+；血漿凝固酶試驗(yàn)+；耐熱性DNA酶試驗(yàn)+。

藥品中金黃色葡萄球菌檢查方法8.1.4抵抗力

本菌抵抗力較強(qiáng)，干燥情況下能生存數(shù)月,80℃30min的條件下尚能存活,5%石炭酸或0.1%升汞溶液10-15mm,70%乙醇在數(shù)分鐘內(nèi)殺死該菌。本菌對(duì)青霉素敏感，但有抗性菌株，且日漸增多；對(duì)磺胺敏感性較低；對(duì)慶大霉素、頭孢菌素較敏感；對(duì)紅霉素、鏈霉素敏感；而對(duì)氯霉素敏感性較差。8.2檢查程序供試液的制備見(jiàn)“藥品中微生物總數(shù)的檢查”。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)：供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10-100cfu，供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的控制菌檢查。陽(yáng)性試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的目的：檢查供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。藥品中金黃色葡萄球菌檢查方法陰性對(duì)照試驗(yàn)：取稀釋劑10ml加入100(或200m1)相應(yīng)控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。陰性對(duì)照試驗(yàn)?zāi)康模簷z查稀釋劑是否滿足無(wú)菌要求及培養(yǎng)條件是否適宜。8.2.1增菌培養(yǎng)

取營(yíng)養(yǎng)肉湯(或亞碲酸鈉肉湯)培養(yǎng)基3份，每份100ml,1份加入10ml供試液；1份加入供試液及陽(yáng)性對(duì)照菌；1份加入與供試液等量的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液(pH7.2)作為陰性對(duì)照，置36℃±1℃培養(yǎng)18-24h(必要時(shí)延至48h)，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。8.2.2分離培養(yǎng)

將上述供試品增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)沾取1-2環(huán)培養(yǎng)液，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)24-72h，當(dāng)供試品分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，或有菌落生長(zhǎng)但不同于表10-5所列特征，可報(bào)告為1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。藥品中金黃色葡萄球菌檢查方法金黃色萄球菌在選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征藥品中金黃色葡萄球菌檢查方法培養(yǎng)基菌落形態(tài)特征卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)，外周有分解卵磷脂后產(chǎn)生的乳濁圈，菌落直徑1-2mm甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)，外周有黃色環(huán)，菌落直徑0.7-1mm8.2.3純培養(yǎng)

當(dāng)供試品分離平板生長(zhǎng)菌落與表10-5所列菌落特征相似或疑似時(shí)應(yīng)速取2-3個(gè)以上菌落，分別用接種針，輕輕沾取菌落中心表面培養(yǎng)物，接種于瓊脂斜面上，于36℃±1℃培養(yǎng)18-24h，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭染色。鏡檢及接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂肉湯36℃±1℃培養(yǎng)18-24h，做血漿凝固酶試驗(yàn)。8.2.4革蘭染色、鏡檢8.2.4.1革蘭染色

見(jiàn)大腸埃希菌。8.2.4.2鏡檢金黃色葡萄球菌為革蘭陰性球菌，無(wú)芽孢，一般不產(chǎn)生莢膜，排列呈不規(guī)則的葡萄狀，亦可呈單個(gè)，成雙或短鏈狀排列。藥品中金黃色葡萄球菌檢查方法8.2.5血漿凝固酶試驗(yàn)

取無(wú)菌試管(10mm×100mm)3支，各加入血漿和0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(1：1)0.5ml。其中1支加入瓊脂斜面培養(yǎng)物菌懸液(或被檢菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液)0.5ml。其余2支作對(duì)照管:1支加入金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]菌懸液和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5ml作為陽(yáng)性對(duì)照；另1支加入營(yíng)養(yǎng)肉湯和0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對(duì)照。3管同時(shí)置36℃±1℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱,3h后開(kāi)始檢查，以后每隔適當(dāng)時(shí)間觀察一次，直至24h。檢查時(shí)，輕輕將試管傾斜(動(dòng)作勿大)，仔細(xì)觀察，陰性對(duì)照管血漿流動(dòng)自如，陽(yáng)性對(duì)照管液呈凝固狀，試驗(yàn)管液呈凝固狀者為陽(yáng)性反應(yīng)；不凝固為陰性反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管任何一管不符合要求時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。藥品中金黃色葡萄球菌檢查方法8.3結(jié)果判斷

如果革蘭氏染色結(jié)果清晰可靠（必要時(shí)加做已知革蘭染色結(jié)果的細(xì)菌進(jìn)行染色質(zhì)量控制），凝固酶試驗(yàn)陰性對(duì)照試驗(yàn)為陰性，陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果，供試品培養(yǎng)物按下列情況報(bào)告或處理。8.3.1疑似菌革蘭染色呈陽(yáng)性球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)者，報(bào)告1g或1ml供試品檢出金黃色葡萄球菌(少許菌株可能不是金黃色葡萄球菌而是葡萄球菌屬的其他菌種）8.3.2革蘭染色鏡檢不是革蘭陽(yáng)性球菌，成血漿凝固酶試驗(yàn)陰性反應(yīng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。8.3.3陰性對(duì)照試驗(yàn)有菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。8.3.4陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性結(jié)果,應(yīng)當(dāng)加做驗(yàn)證試驗(yàn),考察檢品是否有抑菌性。藥品中金黃色葡萄球菌檢查方法8.4注意事項(xiàng)8.4.1金黃色葡萄球菌在上述兩種分離培養(yǎng)基上的典型菌落為金黃色。但由于受藥物影響成非典型菌體存在，亦可呈橙黃色、檸檬色或白色。做控制菌檢查，對(duì)非典型菌落也有必要進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)