基于熒光免疫層析技術快速評價新型冠狀病毒肺炎病毒-cov-2抗體水平的方法

基于熒光免疫層析技術快速評價新型冠狀病毒肺炎病毒-cov-2抗體水平的方法

2019年12月以來，一些醫(yī)院相繼報告了許多無法解釋的肺炎。由于春節(jié)期間人口流動性很高，2020年1月該肺炎迅速傳播到整個中國目前對COVID-19患者的檢測主要采用熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)法、化學發(fā)光法以及膠體金法。熒光定量PCR法檢測人體內提取出的核酸時靈敏度較低，容易出現(xiàn)假陰性，同時由于此類方法的檢測時間長，對于檢測環(huán)境的要求高，不宜于基層醫(yī)院普及SARS-CoV-2核衣殼(N)蛋白是一種豐富的RNA結合蛋白，可在病毒的生命周期中發(fā)揮多種作用本研究基于NC蛋白建立了SARS-CoV-2抗體熒光免疫層析檢測方法，通過對其精密度和穩(wěn)定性進行評價，配合相應的熒光分析儀，實現(xiàn)了人體內SARS-CoV-2抗體水平的評價。整套系統(tǒng)操作簡便，成本低廉，能夠在15min內即時完成檢測，大大降低了檢測時間，可有效提升復工復學群體的檢測效率。1實驗部分1.1微生物細胞的免疫熒光微球(FMs,美國BangsLab公司),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)(中國Aladdin公司),2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物(MES)緩沖液、樣品稀釋液、包被液、微球保護液、微球封閉液、羊抗鼠IgG、鼠IgG、NF蛋白、BL21(DE3)/pET21b-NC菌株、SARS-CoV-2陰性樣本和免疫NC抗原兩周的兔血清(中國河南省生物工程技術研究中心)。PVC板和吸水紙(中國通成紙業(yè)),玻璃纖維素膜(中國JYBiotech公司),XYZ三維點膜噴金儀和微電腦自動斬切機(中國上海金標生物科技有限公司),熒光免疫層析讀數(shù)儀(中國杭州峰航科技有限公司),高電流電泳儀(美國Bio-Rad公司)。1.2鼠igg抗體結合原理本實驗采用雙抗夾心法檢測血清中SARS-CoV-2抗體的水平。將待測血清和樣本稀釋液按照一定比例混合后加入加樣孔中，血清中的SARS-CoV-2抗體會和結合墊上的熒光標記抗原結合形成抗原-抗體復合物，并通過毛細作用沿著液體層析方向移動，隨后通過層析作用逐漸在硝酸纖維素膜(NC膜)上移動，最后被固定在檢測線(T線)上的包被抗原特異性地捕獲，形成抗原-抗體-抗原復合物，而鼠IgG繼續(xù)移動與質控線(C線)上的羊抗鼠IgG抗體結合。其原理如圖1所示。當檢測卡插入熒光檢測儀后，儀器自動讀取檢測卡上T線和C線的熒光信號強度，T/C值可表示待測血清中SARS-CoV-2抗體的水平1.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)基1∶100接種菌株BL21(DE3)/pET21b-NC于1.2LLuria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中(含100μg/mL氨芐青霉素),37℃條件下振蕩培養(yǎng)至OD1.4edc/mes溶液制備取1%固含量的200nm熒光微球40μL于1.5mL離心管中，加入1mL純化水后在15000r/min條件下離心15min。棄上清液后加入1mL20mmol/LMES(pH6.0)緩沖液振蕩混勻，再加入10mg/mLEDC溶液30μL,振蕩混勻，繼續(xù)加入20mg/mLNHS溶液80μL,水浴超聲120s混勻。將其置于臺式恒溫振蕩器中避光活化30min,然后在15000r/min條件下離心15min,棄上清液后加入1mL20mmol/LMES(pH6.0)緩沖液，超聲混勻。1.5鼠igg的模擬在上述溶液中加入待標記抗原30μg振蕩混勻，避光條件下偶聯(lián)1h,繼續(xù)加入20μg鼠IgG,避光條件下偶聯(lián)1h。偶聯(lián)完成后，于15000r/min條件下離心15min,棄上清液，加入封閉液1mL,超聲混勻避光條件下封閉1h。封閉完成的熒光微球于15000r/min條件下離心15min,棄上清液，加入微球保護液1mL,超聲混勻。1.6熒光微球偶聯(lián)物的制備將包被抗原和羊抗鼠IgG噴于硝酸纖維素膜的T線和C線上，質量濃度均為0.5mg/mL,兩帶間隔4mm,置于真空干燥箱中抽真空干燥2h。將制備的熒光微球偶聯(lián)物稀釋后用XYZ噴金劃膜儀噴涂于結合墊上，置真空干燥箱中抽真空干燥5h。將樣品墊、結合墊以及吸水紙按照一定順序組裝在PVC板上，使用微電腦自動斬切機將組裝好的PVC板切成寬度為3.9mm的試紙條(試紙條結構示意圖如圖2所示),將試紙條裝入特定的塑料檢測卡中，以壓卡機壓緊檢測卡上下蓋，置于干燥房待用。1.7熒光免疫層析檢測血清中ss-cov-2抗體基因型別在室溫下將待測血清和樣本稀釋液按照一定比例混合，用移液器吸取80μL稀釋后的血清，垂直懸空緩慢加入到樣品墊上，15min后在熒光免疫層析讀數(shù)儀上進行檢測，讀取對應的T、C值。無論樣品中是否含有SARS-CoV-2抗體，C線都應出現(xiàn)熒光條帶，否則試紙條檢測結果判定為無效。試紙條檢測結果示意圖如圖3所示2結果與討論2.1透皮吸收tis緩沖液洗脫目的蛋白本實驗在對重組菌株BL21(DE3)/pET21b-NC進行培養(yǎng)后，使用鎳親和層析法純化蛋白，以含100mmol/L咪唑的20mmol/LTris(pH8.0,300mmol/LNaCl)緩沖液洗滌雜蛋白，含300mmol/L咪唑上述Tris的緩沖液洗脫目的蛋白。20mmol/LTris(pH8.0)緩沖液透析目的蛋白除去咪唑和NaCl后，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)鑒定，結果見圖4。純化后得到了單一的目的條帶，大小約13kD。2.2不同標準兔血清t/c值的檢測本實驗選擇NF蛋白以及NC蛋白進行配對組合，使用時間分辨免疫層析法對其陰性和陽性進行評價，綜合篩選出較優(yōu)抗原配對組合?？乖鋵Ψ绞綖閮山M，均選擇NF蛋白作為包被抗原，a組使用NF標記，b組使用NC標記，按照“1.4”、“1.5”以及“1.6”中的方法制備試紙條。陰性檢測時將50份待檢測陰性樣本(N1～N50)使用樣本稀釋液稀釋10倍后進行檢測，T值小于500,且T/C小于0.05即為符合要求；通過計算T/C值的平均值將兔血清稀釋10、20、40、80、160倍，并編號為P1、P2、P3、P4、P5,使用研制的試劑卡進行檢測，T值大于1000,且T/C大于0.1即為符合要求；同時設置平行組，并在此基礎上使用樣本稀釋液對兔血清進行稀釋，直至檢測結果不符合陽性檢測標準，結果見表2。a組(NF包被，NF標記)P3(血清稀釋至40倍時)樣品的T值仍大于1000,且T/C大于0.1,P4(血清稀釋至80倍)樣品的T值小于1000,不符合陽性檢測標準；b組(NF包被，NC標記)P4(血清稀釋至80倍)樣品的T值仍大于1000,且T/C大于0.1,P5(稀釋至160倍)樣品的T值小于1000,不符合陽性檢測標準。由此可見，b組的靈敏度優(yōu)于a組。綜合陰性和陽性檢測結果，選擇b組(NF包被，NC標記)抗原配對組合進行性能檢測。2.3批間和批間的精密度本實驗選擇N2、N15、P1、P3以及P55份樣本，分別對同批次試紙條進行批內精密度檢測，再分別對3個不同批次的試紙條進行批間精密度檢測，每個待檢樣本重復檢測10次。計算每個待檢樣本的CV值，對批內和批間精密度進行考察，結果見表3。批內各樣品T/C值的CV范圍為3.48%～10.05%;批間各樣品T/C值的CV范圍為4.77%～11.73%。批內以及批間的CV均小于15%,在允許范圍之內。2.4血清自身毒力基因檢測根據(jù)《2019新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑注冊技術審評要點》選擇肺炎支原體、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及EB病毒陽性血清各3份，每份血清使用本實驗構建的試紙條重復檢測5次。另外檢測3份陰性對照血清，重復5次，分析其特異性。結果見表4,所有4種病毒陽性的血清以及陰性對照血清的檢測結果均為陰性，說明該試紙條有良好的特異性。2.5檢測穩(wěn)定性測定將試紙條與干燥劑一起放入鋁箔袋中密封后，置于37℃干燥箱中保存。分別在3、6、9、12、15、18、21d時取出，于常溫環(huán)境中檢測。每個待檢樣本平行測定3次取平均值，樣本稀釋液4℃保存，考察其穩(wěn)定性。結果見圖5。試紙條在37℃干燥箱保存3、6、9、12、15、18、21d后，T值與放入當天相比變化均在15%以內，說明其穩(wěn)定性良好，可在37℃條件下保存21d。2.6兩種方法檢測的小鼠血清發(fā)熱伴呼吸道癥狀患者的血清符合率隨機抽取本實驗制備的37個試紙條與廣州萬孚生物技術股份有限公司生產的新型冠狀病毒抗體檢測試劑盒(膠體金法)同時對37份COVID-19患病者血清進行檢測；并使用兩種方法檢測118例非COVID-19患病者血清，其中其他發(fā)熱伴呼吸道癥狀病例為76份，計算其符合率，結果見表5。兩種方法的總符合率為96.13%,陽性符合率為90.63%,陰性符合率為97.56%。表明兩種方法之間的相關性良好，本文所研制的試紙條具有一定的商用價值。3基層黨組織新型冠狀病毒肺炎疫情防控效果本實驗基于截短新型冠狀病毒N蛋白開發(fā)的熒光免疫層析試紙條能夠快速評價體內SAR