水稻種質(zhì)資源遺傳多樣性的ssr分析

水稻種質(zhì)資源遺傳多樣性的ssr分析

水稻是重要的耕作種類。不同的地理、生態(tài)和文化環(huán)境形成了豐富多樣的資源組合。優(yōu)良種質(zhì)資源長期保存的費用昂貴,收集新資源、鑒定和淘汰重復的資源是種質(zhì)資源研究的經(jīng)常性任務。隨著分子生物學的發(fā)展,分子標記技術(shù)已廣泛應用于水稻種質(zhì)資源研究。研究以27個優(yōu)異水稻種質(zhì)資源(包括15個優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源和12個光溫敏核不育種質(zhì)資源)為材料,進行SSR分析、多樣性評價和聚類分析,以期為這些稻種資源的遺傳改良和雜交配組提供參考;同時制定各稻種資源的分子身份證,為品種的保護提供依據(jù);進而探索新的分子身份證數(shù)據(jù)記錄方法的可行性,擬在不影響結(jié)果準確性的前提下,減少工作量,簡化步驟,為稻種資源鑒定提供技術(shù)支持。1材料和方法1.1試驗材料選取15個水稻優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源和12個水稻光溫敏核不育種質(zhì)資源作為供試材料(表1)。1.2測試方法1.2.1引用ssor方法的選擇采用中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《水稻品種鑒定DNA指紋方法》(NY/T1433-2007)1.2.2來自水稻組的dna提取參照Murray等1.2.3pcr反應和產(chǎn)物分離PCR反應及產(chǎn)物分離參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T1433-20071.2.4ssr帶型樹狀圖的繪制根據(jù)PAGE凝膠電泳的結(jié)果,在相同遷移率位置上,有帶的記為“1”,無帶的記為“0”,缺失條帶的記為“2”。將統(tǒng)計完的0、1、2數(shù)字矩陣輸入MicrosoftExcel工作表,隨后轉(zhuǎn)化為MicrosoftExcel5.0/95的版本保存,接著用NTedit軟件打開,讀取數(shù)據(jù),將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為.nts的格式保存。然后用NTsys軟件對已經(jīng)用NTedit軟件處理后的數(shù)據(jù)進行資源間遺傳相似系數(shù)(GS)的計算,由遺傳相似系數(shù)的數(shù)據(jù)矩陣,采用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)繪制資源間遺傳關(guān)系樹狀圖。根據(jù)Smith等2結(jié)果與分析2.1ssr引物擴增條帶24對SSR引物在27個資源中共擴增出了104個等位變異片段,平均每對引物擴增的條帶數(shù)為4.3條,圖1是引物RM274擴增的結(jié)果,24對引物擴增的遺傳多樣性信息如表2所示。由表2可知,引物擴增的條帶數(shù)從2條至7條不等,其中SSR引物RM219與RM258擴增的條帶數(shù)均為7,為所有引物中最多。從各引物擴增的條帶數(shù)量分布上來看,擴增條帶數(shù)為2條和7條的引物數(shù)量均為2對,各占8.3%,擴增條帶數(shù)為6條的引物數(shù)量為3對,占12.5%,此外,分別有4對引物擴增的條帶數(shù)為3和5條,各占16.7%,而擴增條帶數(shù)量為4條的引物有9對,數(shù)量最多,占37.5%,即等位基因位點為3~5個的引物占全部引物的70.8%。24對SSR引物在27個資源中的平均Nei基因多樣性指數(shù)為0.533,不同引物的Nei基因多樣性指數(shù)變化范圍為0.071~0.820。由于Nei基因多樣性指數(shù)是等位基因數(shù)和頻率的函數(shù)24對SSR引物在15個優(yōu)質(zhì)水稻資源中共擴增出85條條帶,引物擴增的條帶數(shù)從2條至6條不等,平均每對SSR引物擴增的條帶數(shù)為3.5條;不同引物的Nei基因多樣性指數(shù)變化范圍為0.124~0.738,平均Nei基因多樣性指數(shù)為0.482。而在光溫敏核不育資源中共擴增出76條條帶,每對引物的擴增條帶數(shù)同樣從2條至6條不等,平均每對SSR引物擴增條帶數(shù)為3.2條;不同引物的Nei基因多樣性指數(shù)變化范圍為0~0.778,平均Nei基因多樣性指數(shù)為0.497,略高于優(yōu)質(zhì)資源。2.2聚類分析和分子標記的計算根據(jù)SSR分子標記數(shù)據(jù)得到的在優(yōu)質(zhì)資源和光溫敏核不育資源總共27個資源中的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.5481~0.9327,平均遺傳相似系數(shù)為0.7536,其中資源1892S和C815S的遺傳相似系數(shù)最大,為0.9327,表明兩者的親緣關(guān)系在所用試驗種質(zhì)資源中較近;資源04-657與04-658的遺傳相似系數(shù)最小,為0.5481,表明兩者的親緣關(guān)系在所用試驗種質(zhì)資源中較遠。忽略優(yōu)質(zhì)資源和光溫敏核不育資源各自自身的聚類,兩個資源群體間的遺傳相似系數(shù)為0.5865~0.8846,其中遺傳相似系數(shù)為0.8846的兩個資源分別是Basmatisuperfine與2301S,而遺傳相似系數(shù)為0.5865的兩個資源分別是04-658和1103S。將優(yōu)質(zhì)資源的SSR分子標記數(shù)據(jù)單獨統(tǒng)計,進行遺傳相似系數(shù)的計算,其變化范圍為0.4471~0.8706,平均遺傳相似系數(shù)為0.7043。優(yōu)質(zhì)資源霸王占與9598的遺傳相似系數(shù)最大(0.8706),而優(yōu)質(zhì)資源04-657與04-658的遺傳相似系數(shù)最小(0.4471),該結(jié)果與27個資源總體聚類結(jié)果吻合。將光溫敏核不育資源的SSR分子標記數(shù)據(jù)單獨統(tǒng)計,進行遺傳相似系數(shù)的計算,其變化范圍為0.4474~0.9079,平均遺傳相似系數(shù)為0.6573。不育資源1892S和C815S的遺傳相似系數(shù)最大(0.9079),該結(jié)果符合27個資源總體聚類結(jié)果,而不育資源1103S與HN5S-12的遺傳相似系數(shù)最小(0.4474)。2.3類材料聚類分析圖2、圖3、圖4分別為優(yōu)質(zhì)資源、光溫敏核不育資源以及優(yōu)質(zhì)和光溫敏核不育資源總體的UPG-MA聚類分析結(jié)果。從圖2可以看出,在遺傳相似系數(shù)0.58處,可以將優(yōu)質(zhì)資源分為兩類,Ⅱ類只包含一個泰國資源04-658,剩下的其他14個資源為Ⅰ類,表明泰國資源04-658與其他優(yōu)質(zhì)資源的親緣關(guān)系較遠。在Ⅰ類中,在遺傳相似系數(shù)接近0.72處,又可分為5類,鑒真2號、Basmati、晚秈98分別單獨為一類,泰國資源04-657與Basmatisuperfine聚為一類,以鄂中5號、銀占等為代表的湖北資源聚為一類,以西山占、霸王占等為代表的廣西資源聚為一類,分類大致接近于同一地理資源來源聚為一類。分析不育資源聚類分析圖(圖3),在遺傳相似系數(shù)0.61處,可將這些不育資源分為三類,Ⅰ類中的資源有1892S、C815S、Y58S、15S、培矮64S、HN5S-12和HN5S-11,這7個資源中的前3個均與培矮64S有親緣關(guān)系;Ⅱ類資源有2301S、廣占63S、M6303S和HD9802S,其中的M6303S與廣占63S存在系譜上的親緣關(guān)系;Ⅲ類材料僅有1103S。分析優(yōu)質(zhì)資源和不育資源的聚類分析圖(圖4),在遺傳相似系數(shù)0.70處可將27個資源分為四類,Ⅱ類包含珠海占與1103S,Ⅲ類為晚秈98,Ⅳ類包含04-658與HD9802S,其他22個資源組成Ⅰ類。2.4聚類分子身份證的內(nèi)容將SSR分子標記條帶統(tǒng)計的“0”、“1”結(jié)果,按照表單中引物的順序統(tǒng)計成二進制數(shù)據(jù),作為優(yōu)質(zhì)及不育資源的二進制分子身份證,然后再將二進制數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為十進制數(shù)據(jù),作為優(yōu)質(zhì)及不育資源的十進制分子身份證。通過將SSR分子標記統(tǒng)計的“0”、“1”數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為十進制數(shù)據(jù)可知,在優(yōu)質(zhì)資源中,各品種的DNA分子身份證由原來85位的二進制數(shù)據(jù)減少為25~26位的十進制數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)量減少至原數(shù)據(jù)量的30%左右,而在光溫敏核不育資源中,各資源的DNA分子身份證由原來76位的二進制數(shù)據(jù)減少為23位的十進制數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)量相比原來的數(shù)據(jù)量同樣減少了約70%。比較十進制的分子身份證數(shù)據(jù),以優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的聚類為例,可以發(fā)現(xiàn),以二進制分子身份證聚類在一大類的資源,如西山占、霸王占、18-08和柳沙油占,它們的十進制分子身份證的前五位數(shù)均是相同的。而在聚類上與其他種質(zhì)資源均較遠的資源04-658,它的十進制分子身份證與其他的種質(zhì)資源均不相同。在不育資源的聚類中,遺傳相似系數(shù)最大的兩個資源(1892S與C815S)的十進制分子身份證的前8位數(shù)完全相同,超過了任何其他資源十進制分子身份證之間的相似度。以上這些都表明十進制分子身份證數(shù)據(jù)能夠大體反映二進制的數(shù)據(jù),十進制分子身份證是以首位至末位數(shù)之間的相似程度來反映資源之間親緣關(guān)系遠近的。但是同時也可看到,在優(yōu)質(zhì)資源二進制聚類中與霸王占較近的種質(zhì)資源9598,它的十進制分子身份證卻與霸王占不同。關(guān)于這些有出入的地方還有待進一步研究。優(yōu)質(zhì)及不育資源的二進制及十進制分子身份證見表3。3討論3.1ssr引物多態(tài)性分析前人研究表明,分子標記技術(shù)可以在DNA水平將作物的種質(zhì)有效區(qū)分開來,而且分子標記技術(shù)的分析結(jié)果與系譜分析結(jié)果吻合性較高研究中24對SSR引物對光溫敏核不育種質(zhì)資源的聚類結(jié)果與系譜圖具有較高的吻合度,說明用這24對引物可以將這些光溫敏核不育種質(zhì)資源區(qū)分開。而反觀優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的SSR分析聚類結(jié)果,雖與系譜圖大致吻合,但還是有出入,分析認為,推薦的24對SSR引物對于國內(nèi)種質(zhì)資源具有較好的區(qū)分度,所以對于國內(nèi)種質(zhì)資源使用這24對引物去區(qū)分已經(jīng)足夠。而在優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源中,由于存在國外的以及一些不明來源的種質(zhì)資源,可能對聚類結(jié)果的真實性有一定的干擾,因此僅僅使用24對引物可能還不夠,應該加大引物的使用數(shù)量。3.2種質(zhì)資源指紋圖譜將二進制的分子身份證數(shù)字串轉(zhuǎn)化為十進制的數(shù)字串后,數(shù)據(jù)量