青海省審定小麥品種ssr遺傳多樣性分析

青海省審定小麥品種ssr遺傳多樣性分析

科學(xué)通用代碼（osid）：。小麥?zhǔn)俏覈?guó)第二大糧食作物，產(chǎn)量?jī)H次于水稻。已培育的大量小麥品種，在提高糧食產(chǎn)量、提升小麥品質(zhì)等方面發(fā)揮了重要作用。科學(xué)準(zhǔn)確地鑒別品種及其遺傳特異性，對(duì)種子質(zhì)量鑒定、遺傳資源評(píng)價(jià)和品種權(quán)益保護(hù)均具重要意義。傳統(tǒng)的方法基于形態(tài)和農(nóng)藝性狀，按照國(guó)家制定的統(tǒng)一規(guī)范的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)，在特定時(shí)期和規(guī)定群體內(nèi)對(duì)被測(cè)試的品種進(jìn)行表型性狀的描述與鑒定。表型性狀易受環(huán)境影響而發(fā)生變化，難以有效地鑒別表型相近和遺傳關(guān)系較密切的品種，因而受到限制，不能廣泛應(yīng)用研究表明，同一物種的不同品種間存在著大量的多態(tài)性分子標(biāo)記，如果某一品種具有與其他品種不同的獨(dú)特標(biāo)記，這些標(biāo)記的組合可以構(gòu)建該品種的指紋圖譜1材料和方法1.1代和60年代測(cè)定的品種有試驗(yàn)材料為66個(gè)春小麥品種，其中，20世紀(jì)50年代和60年代審定的品種各1個(gè)，70年代審定的品種4個(gè)，80年代審定的品種12個(gè)，90年代審定的品種22個(gè)，2000-2009年審定的品種26個(gè)。1.2測(cè)試方法1.2.1基因組dna提取將2～3g新鮮葉片放入研缽中加液氮研磨至粉末，利用CTAB法提取基因組DNA，稀釋后測(cè)定濃度，以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，樣品在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試?yàn)在中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所高原生態(tài)農(nóng)業(yè)研究中心完成。1.2.2由ssr標(biāo)記索引合成和篩選根據(jù)R?der等1.2.3變性復(fù)性20sPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min,94℃變性1min,50～60℃（依引物而定）復(fù)性50s,72℃延伸30s,35次循環(huán)后72℃延伸10min,4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳分離，硝酸銀染色顯影。1.2.4試材料的分布統(tǒng)計(jì)同一SSR引物擴(kuò)增條帶（等位變異）在各參試材料中的分布情況。如果無(wú)擴(kuò)增，記為0；如果有擴(kuò)增，則按其產(chǎn)物分子量從大到小的順序，分別記錄為1、2、3、……，直到分子量最小的產(chǎn)物為止。1.3ssr數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析多態(tài)信息含量（polymorphisminformationcontent,PIC）用于測(cè)定每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性分辨能力，不僅考慮到位點(diǎn)上存在的等位基因數(shù)，還考慮到這些等位基因的相對(duì)頻率。計(jì)算公式PIC等位變異數(shù)（allelicvariation,N采用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)開(kāi)發(fā)的遺傳統(tǒng)計(jì)分析軟件GeneticsStatistics3.0（登記號(hào)：2007SR11872）分析品種特異指數(shù)。利用資源特征分析軟件IDAnalysis1.0（登記號(hào)：2007SR11870）建立品種分子身份證ID。缺失位點(diǎn)過(guò)多和相似系數(shù)過(guò)高的引物首先被淘汰，然后以最少的引物組合鑒定品種。2結(jié)果與分析2.1引物的篩選及其多樣性520對(duì)SSR引物中，有212對(duì)具有清晰的擴(kuò)增條帶。其中19對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)為單態(tài)，占8.96%，其余193對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)為多態(tài)，多態(tài)性引物頻率為91.04%。擴(kuò)增條帶在小麥21條染色體上的分布從7(3D）到13個(gè)（5A）。193對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增出724個(gè)等位變異，變異范圍為2～10個(gè)，平均每個(gè)多態(tài)引物擴(kuò)增的等位變異數(shù)為3.75個(gè)。擴(kuò)增的等位變異數(shù)為3個(gè)的引物有58對(duì)，占多態(tài)性引物的30.05%，頻率最高；擴(kuò)增的等位變異數(shù)為2個(gè)的引物有49對(duì)，占多態(tài)性引物的25.39%，頻率次之；擴(kuò)增等位變異數(shù)在7個(gè)（含）以上的引物僅有15個(gè)，頻率為7.77%（圖1）。各位點(diǎn)多態(tài)信息含量的變化范圍是0.03～0.86，平均為0.51。212對(duì)引物在小麥A、B和D基因組的分布情況，以及每個(gè)基因組的等位變異數(shù)和多樣性指標(biāo)不同（表1）。A、B和D基因組檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)分別是77、68和67，平均等位變異豐富度分別為3.83、3.47和3.16(A>B>D），平均遺傳多樣性指數(shù)分別為0.50、0.45和0.43(A>B>D）。將2個(gè)多樣性指標(biāo)綜合起來(lái)看，A基因組多樣性較高，B基因組的多樣性次之，D基因組的多樣性最低，這可能是因?yàn)镈基因組含有更多控制重要農(nóng)藝性狀的基因，育種過(guò)程中，對(duì)其選擇壓力較大，致使其多樣性降低。7個(gè)同源群中，第2群的平均等位變異豐富度最高，第7群最低，其排列順序依次為：第2群（3.97）>第1群（3.71）>第4群（3.59）>第6群（3.43）>第3群（3.37）>第5群（3.35）>第7群（3.10）。7個(gè)同源群的平均遺傳多樣性指數(shù)從高到低依次為：第2群（0.51）=第3群（0.51）>第6群（0.48）>第1群（0.47）>第4群（0.44）>第5群（0.42）>第7群（0.41）。綜合2個(gè)指標(biāo)得出，第2同源群遺傳多樣性指數(shù)最高，第7同源群遺傳多樣性指數(shù)最低。2.2小麥品種的特異性指數(shù)每一個(gè)供試小麥品種用212對(duì)SSR引物擴(kuò)增后，根據(jù)電泳條帶大小用數(shù)字依次記錄其等位基因，然后應(yīng)用軟件GeneticsStatistics3.0計(jì)算獲得每個(gè)小麥品種的特異性指數(shù)（表2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，品種民和665的特異性指數(shù)最小（539.725），高原584的特異性指數(shù)最大（1250.777），所有品種的平均特異性指數(shù)為772.000。品種特異性指數(shù)越高表明該品種中特異等位基因數(shù)目越多，利用SSR引物擴(kuò)增出的特異性片段越多，越容易與其他品種區(qū)分開(kāi)，可為小麥品種資源的鑒定與保存提供參考。2.3小麥品種分子身份證的建立品種ID可以分為2類(lèi)，一類(lèi)以特異等位基因區(qū)分品種，如高原671具有cfa2153的第1個(gè)特異等位基因，高原175具有wmc154的第3個(gè)特異等位基因，這些特異等位基因可以直接鑒別品種。另一類(lèi)由于大部分品種都沒(méi)有特異等位基因，需要利用多個(gè)引物的等位基因組合進(jìn)行區(qū)分。由于本研究使用的引物在供試材料中的多態(tài)性較低，需要利用gwm294、wmc622、wmc672、wmc468、wmc262、wmc657、wmc705、gwm169、wmc413、gwm425、barc170、barc343、gwm437、barc216、wmc332、gwm635、gwm219、barc319、barc213、wmc650、wmc487、wmc517和bacrc198共23對(duì)引物將供試的66個(gè)小麥品種區(qū)分開(kāi)，并建立這些小麥品種的分子身份證（表2）。以表2中的青春37為例，其分子身份證為38577572724636631433461，按上述23對(duì)引物順序，第1個(gè)引物在該品種中擴(kuò)增出的等位基因被記錄為3，第2個(gè)引物擴(kuò)增出的等位基因被記錄為8，第3個(gè)引物擴(kuò)增出的等位基因被記錄為5，依此類(lèi)推，直到第23個(gè)引物在青春37擴(kuò)增出的等位基因被記錄為1，其中0表示該位點(diǎn)缺失。由這23個(gè)引物在該品種中擴(kuò)增出的等位基因所對(duì)應(yīng)的數(shù)字組合而成的數(shù)字串，就代表該品種的分子ID。3小麥d基因組的穩(wěn)定性遺傳多樣性分析是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的重要方法，可為育種家在種質(zhì)創(chuàng)新和親本選配過(guò)程中提供有力參考，使雜交親本的選擇更有針對(duì)性，顯著提高育種效率小麥的D基因組來(lái)源于粗山羊草，其多樣性指數(shù)最低，可能是因?yàn)樵摶蚪M攜帶的基因控制較多重要的農(nóng)藝性狀，在長(zhǎng)期育種過(guò)程中經(jīng)歷了較強(qiáng)選擇作用導(dǎo)致的。本研究在青海省育成的小麥品種中，獲得了相同的研究結(jié)果，說(shuō)明D基因組相對(duì)保守。用于構(gòu)建品種分子身份證的DNA分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、帶型清晰、操作