腫瘤細胞和分化凋亡專家講座

細胞凋亡生物學意義

胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)生細胞穩(wěn)態(tài)和免疫機制衰老腫瘤發(fā)生及化學治療

腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第1頁細胞凋亡和惡性腫瘤1Bcl－2和惡性腫瘤2P53和惡性腫瘤3Bcr-abl和惡性腫瘤4PML-RARα蛋白和惡性腫瘤腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第2頁細胞凋亡干預(yù)和腫瘤治療1野生型P53基因介導腫瘤治療2Bcl－2基因介導腫瘤治療3泛素－蛋白酶體降解路徑介導腫瘤治療4三氧化二砷介導血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療5DADS誘導腫瘤細胞凋亡腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第3頁細胞凋亡檢測方法1臺肦藍（trypanblue)染色法原理：trypanblue是一個細胞膜非通透性染料。壞死細胞因細胞膜受損而被臺肦藍著色染色。所以，該法能區(qū)分細胞生存狀態(tài)，簡單、便捷、常規(guī)用于細胞死亡初步評價和細胞存活率評價。注意事項：該法不能區(qū)分繼發(fā)性壞死和真正意義上壞死細胞；也輕易低估細胞死亡程度。（因為早期凋亡細胞含有完整細胞膜而被誤看成活細胞）腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第4頁2.丫啶橙染色（acridineorange,AO)和溴化乙啶(ethidiumbromide,EB)雙染法

原理：AO和EB都是結(jié)合DNA熒光染料，分別產(chǎn)生藍色和橙色熒光。其中，AO能透過完整細胞膜，而EB則只能染色胞膜受損細胞。所以，AO/EB雙染法能借助熒光顯微鏡或流式細胞儀區(qū)分活細胞或早期凋亡細胞和壞死或繼發(fā)性壞死細胞。

注意事項：應(yīng)用單一形態(tài)學計數(shù)凋亡細胞數(shù)（凋亡指數(shù)，apoptosisindex)常受到主觀原因干擾，其個體間甚至同一主體重復(fù)性較差。

腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第5頁熒光顯微鏡觀察

圖9A未處理HL-60細胞圖9BDADS處理HL-60細胞吖啶橙×40吖啶橙×40腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第6頁3電子顯微鏡觀察法

電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察雖可顯示凋亡細胞許多特點，如膜發(fā)泡和一些結(jié)構(gòu)如微纖毛丟失、染色質(zhì)固縮和線粒體超濃縮等，但因為樣本制備復(fù)雜、耗時，該項技術(shù)主要用于獲取細胞凋亡定性檢測。腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第7頁腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第8頁3透射電鏡觀察

圖8A未處理HL-60細胞圖8BDADS處理HL-60細胞透射電鏡×6000透射電鏡×6000腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第9頁4DNA斷片法或稱瓊脂糖凝膠電泳“梯形條帶”圖譜法

原理：凋亡細胞基因組DNA常首先被剪切為200-300kb和30-50kb片斷（“結(jié)構(gòu)域式”剪切），再深入降解產(chǎn)生大小相當于核小體(160-200bp)倍數(shù)寡核小體片斷（“裂解”/“梯子式”剪切）。所以，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上凋亡細胞表現(xiàn)為特征性“梯子”樣外觀。注意事項：梯狀DNA(DNAladder)現(xiàn)象常被看作是細胞凋亡主要生物化學標志。不過，日益增多資料顯示并不是全部表現(xiàn)凋亡形態(tài)學特征細胞都是展現(xiàn)這種梯子樣外觀。所以，缺乏梯狀DNA并不能排除細胞凋亡存在。據(jù)報道，一些細胞系如K562細胞凋亡常發(fā)生單鏈而不是雙鏈DNA降解，故不能形成“DNAladder”。另外，普通凋亡率要在15%以上才能展現(xiàn)經(jīng)典“DNAladder”。故有DNAladder能夠必定凋亡存在，沒有DNAladder不能排除凋亡存在。腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第10頁圖5不一樣濃度DADS作用HL-60細胞24h后DNA梯狀條帶形成圖660μmol·L-1

DADS作用HL-60細胞不一樣時間后DNA梯狀條帶形成腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第11頁５.TUNEL法（末端DNA轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標識法）

原理：DNA聚合酶能夠填補雙鏈DNA中單鏈缺失部分，應(yīng)用放射性同位素、生物素和熒光素等標識三磷酸核苷酸形成新DNA。TUNEL法是在含標識dUTP反應(yīng)體系中，加以末端DNA轉(zhuǎn)移酶。故又稱為TdT(terminaldeoxy-transferase)法。該法是應(yīng)用無需模板DNA聚合酶，延伸核苷酸堿基序列與DNA底物無關(guān)。注意事項：該法只能了解DNA是否斷裂和發(fā)生DNA斷裂細胞數(shù)量，即使在理論上對這種方法特異性還有爭議，但操作簡便，而且可大量應(yīng)用于回顧性研究，從而成為當前較為流行細胞凋亡評價方法。腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第12頁TUNEL檢測結(jié)果

圖10A未處理HL-60細胞圖10BDADS處理HL-60細胞TUNEL×20TUNEL×20腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第13頁6PI染色流式細胞術(shù)測定凋亡率

原理：試驗證實凋亡細胞在固定和清洗過程中降解小分子量DNA外漏，造成細胞內(nèi)DNA含量降低。所以，應(yīng)用DNA特異熒光染料（如碘化丙啶，propidiumiodide,PI）染色后，在FCM進行細胞周期分析中，凋亡細胞常以亞二聚體形式出現(xiàn)。亞二倍體細胞群被稱為亞G1期（sub-G1)細胞。它出現(xiàn)被認為是凋亡細胞主要標志。注意事項：識別亞G1期細胞同時，必須將它和細胞碎片區(qū)分開來，因為細胞碎片DNA含量也顯著低于G1期細胞。腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第14頁2.3流式細胞儀檢測凋亡率

control5mg·L-1DADS7.5mg·L-1DADS10mg·L-1DADS15mg·L-1DADS20mg·L-1DADS10mg·L-1DADS+PD10mg·L-1DADS+SB腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第15頁圖7PI/AnnexinV雙染色檢測DADS作用HL-60細胞12h后凋亡率改變腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第16頁3.3流式細胞儀檢測凋亡率

腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第17頁圖12PI/Anexin-V雙染色流式細胞儀檢測DADS作用K562細胞12h后凋亡率改變腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第18頁EFGH圖13流式細胞儀檢測DADS作用K562細胞24h、48h后凋亡率改變腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第19頁細胞凋亡死亡受體相關(guān)信號路徑

腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第20頁細胞凋亡死亡受體相關(guān)信號路徑

表3caspase家族主要組員序號原名功效底物特異性Caspase-1ICE輔助炎癥WEHDCaspase-2ICH-1凋亡反應(yīng)DEXDCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反應(yīng)DEXDCaspase-4ICErel-Ⅱ,TX,ICH-2輔助促炎癥WEHDCaspase-5ICErel-Ⅲ,TY輔助促炎癥WEHDCaspase-6Mch-3凋亡反應(yīng)(I/L/V)EXDCaspase-7Mch-3,ICE-LAP3,CMH-1凋亡反應(yīng)DEXDCaspase-8FLICE,MACH,Mch-5凋亡反應(yīng)(I/L/V)EXDCaspase-9ICE-LAP6.Mch6凋亡反應(yīng)(I/L/V)EXDCaspase-10Mch4凋亡反應(yīng)Caspase-11ICH-3Caspase-12Caspase-13ERICHCaspase-14MICE(Mini-ICE)腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第21頁Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHHL-60Time(h)0124824圖30DADS作用HL-60細胞后caspase3表示改變腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第22頁Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHK562Time(h)0124824圖31DADS作用K562細胞后caspase3表示改變腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第23頁Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHRajiTime(h)0124824圖32DADS作用Raji細胞后caspase3表示改變腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第24頁細胞凋亡線粒體相關(guān)信號路徑MMP開放線粒體外膜PBRCyclophilinDANTPorin△φm下降A(chǔ)IFCytoC/Apaf-1/procaspase-9caspase-9-caspase-8caspase-3apoptosis腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第25頁BaxMitoTrackeroverlay

圖34激光共聚焦檢測HL-60細胞中Bax線粒體轉(zhuǎn)位腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第26頁overlayMitoTrackerBax

圖35激光共聚焦檢測K562細胞中Bax線粒體轉(zhuǎn)位腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第27頁DADS經(jīng)過開啟Mcl-1/Bid/Bax/Caspase-9/Caspase-3線粒體凋亡通路誘導HL-60和K562細胞凋亡。腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第28頁MMP開放和caspase活化“正反饋”環(huán)MMP開放Caspase-3活化線粒體膜屏障功效破壞線粒體腫脹CyotoC釋放Apoptosome（procaspase-9/Apaf-1/CytoC）Caspase-9活化膜間蛋白（如AIF）釋放刺激ceremide酶活化剪切MMP復(fù)合物凋亡誘導劑結(jié)合Apaf-1和procaspase-9腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第29頁內(nèi)源性細胞凋亡抑制物1Caspase－8（FLICE)抑制蛋白（FLIP)2SODD(silencerofdeathdomain)3IAP（inhibitorofapoptosisprotein)4Survivin5Bcl-2家族蛋白腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第30頁Bcl－2家族蛋白結(jié)構(gòu)和功效Bcl－2兩大結(jié)構(gòu)域：TMBHBcl－2家族蛋白活性調(diào)整Bcl－2家族蛋白效應(yīng)機制腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第31頁MCL1Bcl-2BidBaxBakGAPDHHL-60Time(h)0124824圖24DADS處理HL-60細胞后Bcl-2家族組員表示改變腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第32頁GAPDHBakBaxBcl-2K562BidTime(h)0124824圖25DADS作用K562細胞后Bcl-2家族組員表示改變MCL1腫瘤細胞和分化凋亡專家講座第33頁Time(h)0124824MCL1Bcl