中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)操作規(guī)程紫外-可見分光光度法

中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)操作規(guī)程紫外-可見分光光度法

紫外—可見分光光度法簡述紫外一可見分光光度法是通過被瀏物質(zhì)在紫外光區(qū)或可見光區(qū)的特定波特長或確定波長范圍內(nèi)的吸光度,對該物質(zhì)進(jìn)展定性和定量分析的方法。

本法在藥品檢驗(yàn)中主要用于藥品的鑒別、檢查和含量測定。

定量分析通常選擇物質(zhì)的最大吸取波特長測出吸光度,然后用比照品或吸取系數(shù)求算出被測物質(zhì)的含量,多用于制劑的含量測定;對物質(zhì)定性可用吸取峰波長或吸光度比值作為鑒別方法;假設(shè)該物質(zhì)本身在紫外光區(qū)無吸取,而其雜質(zhì)在紫外光區(qū)有相當(dāng)強(qiáng)度的吸取,或雜質(zhì)的吸取峰處該物質(zhì)無吸取,則可用本法作雜質(zhì)檢查。

物質(zhì)對紫外輻射的吸取是由于分子中原子的外層電子躍遷所產(chǎn)生,因此,紫外吸取主要準(zhǔn)備于分子的電子構(gòu)造,故紫外光譜又稱電子光譜。

有機(jī)化合物分子構(gòu)造中如含有共軛體系、芳香環(huán)等發(fā)色基團(tuán),均可在紫外區(qū)200~400或可見光區(qū)400~850產(chǎn)生吸取。

通常使用的紫外一可見分光光度計(jì)的工作波長范圍為190—-定律為光的吸取定律,它是紫外分光光度法定量分析的依據(jù),其數(shù)學(xué)表達(dá)式為:式中:—為吸光度;—為透光率;—為吸取系數(shù);—為溶液濃度,—為光路長度。

如溶液的濃度為1%,光路長度,以表示。

如溶液的濃度為摩爾濃度,光路長度為時(shí),則相應(yīng)的吸取系數(shù)為摩爾吸取系數(shù),以ε表示。

儀器紫外一可見分光光度計(jì)主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、記錄儀、顯示系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等局部組成。

為了滿意紫外一可見光區(qū)全波長范圍的測定,儀器備有兩種光源,即氘燈和碘鎢燈,前者用于紫外區(qū),后者用于可見光區(qū)。

單色器通常由進(jìn)光狹縫、出光狹縫、平行光裝置、色散元件,聚焦透鏡或反射鏡等組成。

色散元件有棱鏡和光柵兩種,棱鏡多用自然石英或熔融硅石制成,對200400波長光的色散力氣很強(qiáng),對600以上波長的光色散力氣較差,棱鏡色散所得的光譜為非勻捧光譜,光柵系將反射或透射光經(jīng)衍射而到達(dá)色散作用,故常稱為衍射光柵,光柵光譜是按波長作線性排列,故為勻排光譜,雙光束儀器多用光柵為色散元件。

檢測器有光電管和光電倍增管兩種。

紫外一可見分光光度計(jì)依據(jù)其構(gòu)造和測量操作方式的不同可分為單光束和雙光束分光光度計(jì)兩類。

單光束分光光度計(jì)有些仍為手工操作,即固定在某一波長,分別測量比較空白、樣品或參比的透光率或吸光度,操作比較費(fèi)時(shí),用于繪制吸取光譜圖時(shí)很不便利,和參比兩光束,并先后到達(dá)檢測器,檢測器信號經(jīng)調(diào)制分別成兩光路對應(yīng)信號,信號的比值可直接用記錄儀記錄,雙光束分光光度計(jì)操作簡潔,測量快速,自動(dòng)化程度高,但作含量測定時(shí),為求精確?????起見,紫外一可見分光光度計(jì)波長精確?????度允許誤差,紫外區(qū)為士,500處士2。

波長精確?????度檢定方法用低壓***燈檢定關(guān)閉儀器光源,將***燈〔用筆式***燈最便利〕直接對準(zhǔn)進(jìn)光狹縫,如為雙光束儀器,用單光束能量測定方式,承受波長掃描方式,掃描速度“慢”如15、響應(yīng)“快”、最小狹縫寬度、量程0—100%,在200—800范圍內(nèi)單方向重復(fù)掃描3次,由儀器識別記錄各峰值〔假設(shè)儀器無“峰檢測”功能,必要時(shí)可對指定波進(jìn)步行“單峰”掃描〕。

單光束儀器以751型為例,,透光率讀數(shù)放在100〔或選擇開關(guān)放在1,透光率放在10〕,關(guān)小狹縫,翻開光閘門,緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)波長盤,查找***,假設(shè)與波長讀數(shù)不符,應(yīng)調(diào)整儀器左側(cè)準(zhǔn)直鏡的波長調(diào)整螺絲,如波長向短波長方向移動(dòng),應(yīng)順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)波長調(diào)整螺絲,如向長波方向移動(dòng),則應(yīng)反時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)波長調(diào)整螺絲,調(diào)整好后,再按***燈的以下譜線測試,記錄每條譜線與儀器波長讀數(shù)的誤差。

用于檢定紫外一可見分光光度計(jì)的***燈譜線波長:、、、、、、、、、、〔紫色〕、〔藍(lán)色〕、〔綠色〕、〔黃色〕。

,測量條件同上述低壓***燈的方法,。

用氧化鈥玻璃檢定,,應(yīng)考慮記錄儀的時(shí)間常數(shù),測定樣品與校正時(shí)取同一掃描速度。

、、、、、、、,可供波長檢定用。

氧化鈥玻璃因制造的緣由,每片氧化鈥的吸取峰波長有差異,另外,在放置過程中也會(huì)發(fā)生波長漂移,因此需定期由計(jì)量部門校驗(yàn)。

用高***酸鈥溶液檢定本法可供沒有單光束測定功能的雙光束紫外分光光度計(jì)波長精確?????度檢定用。

高***酸鈥溶液的配制方法:取10%高***酸為溶劑,參加氧化鈥23配成4%溶液即得。

高***酸欽溶液較強(qiáng)的吸取峰波長為241.13、、、、、、、、、、,但不是數(shù)據(jù)貯存型的〔指是直接將信號描記于記錄紙上〕,記錄的波長可能因記錄筆滯后而非真實(shí)波長,為了精確?????測定,建議承受定點(diǎn)檢定而不用掃描方式。

吸光度精確?????度周密稱取在120℃枯燥至恒重的基準(zhǔn)***鉀約60,置100量瓶中,,用配對的1石英池,。

硫酸液為空白,在235、257、313、350分別測定吸光度,然后換算成,測得值應(yīng)符合表1中規(guī)定的允差范圍。

表1分光光度法允差范圍波長〔〕吸取強(qiáng)度吸取系數(shù)〔〕~~~~、基線平直度、穩(wěn)定度、絕緣電阻等項(xiàng)檢定,按現(xiàn)行國家技術(shù)監(jiān)視局“雙光束紫外一可見分光光度計(jì)檢定規(guī)程”檢定,應(yīng)符合有關(guān)項(xiàng)下的規(guī)定。

日常使用中,對以上兩項(xiàng),即波長和吸光度精確?????度應(yīng)依據(jù)需要隨時(shí)檢查。

雜散光的檢查可按表2所列的試劑和濃度,配制成水溶液,置1石英池中,在規(guī)定的波特長測定透光率,應(yīng)符合表2中規(guī)定。

表2雜散光的檢查及限度試劑濃度〔%,〕測定波速〔〕透光率〔%〕***〔性狀項(xiàng)下〕按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制供試品溶液,在規(guī)定的波特長〔〕測定其吸光度,并計(jì)算吸取系數(shù),應(yīng)符合規(guī)定范圍。

鑒別及檢查按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,測定供試品溶液的最大及最小吸取波長,有的并須測定其在最大吸取波長與最小吸取波特長的吸光度比值,均應(yīng)符合規(guī)定。

含量測定比照晶比較法按各晶種項(xiàng)下規(guī)定的方法,分別配制供試品溶液和比照品溶液,比照品溶液中所含被測成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測成分標(biāo)示量的100%10%以內(nèi),用同一溶劑,在規(guī)定的波特長測定供試品溶液和比照品溶液的吸光度。

吸取系數(shù)法按各品種項(xiàng)下配制供試品溶液,在規(guī)定的波長及該波長2處測定其吸光度,按各該品種在規(guī)定條件下給出的吸取系數(shù)計(jì)算含量。

用本法測定時(shí),吸取系數(shù)通常應(yīng)大于100,并留意儀器的校正和檢定,如測定品種的吸取系數(shù),需按后列“吸取系數(shù)測定法”的規(guī)定進(jìn)展。

計(jì)算分光光度法按《中國藥典》規(guī)定,計(jì)算分光光度法一般不宜用于含量測定,對于少數(shù)承受計(jì)算分光光度法的品種,應(yīng)嚴(yán)格按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)展。

用本法時(shí)應(yīng)留意:有一些吸光度是在待測成分吸取曲線的上升或下降陡坡處測定,影響精度的因素較多,故應(yīng)仔細(xì)操作,盡量使供試品和比照品的測定條件全都。

假設(shè)該品種不用比照品,如維生素測定法〔見《中國藥典》附錄〕,則應(yīng)在測定前對儀器作仔細(xì)的校正和檢定。

比色法供試品本身在紫外一可見光區(qū)沒有強(qiáng)吸取,或在紫外光區(qū)雖有吸取但為了避開干擾或提高靈敏度,參加適當(dāng)?shù)娘@色劑,使反響產(chǎn)物的最大吸取移至可見光區(qū)。

用比色法測定時(shí),由于顯色時(shí)影響顯色深淺的因素較多,應(yīng)取供試品與比照品或標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)操作。

除另有規(guī)定外,比色法所用的空白系指用同體積的溶劑代替比照品或供試品溶液,然后依次參加等量的相應(yīng)試劑,并用同樣方法處理。

當(dāng)吸光度和濃度關(guān)系不呈良好線性時(shí),應(yīng)取數(shù)份梯度量比照品溶液,用溶劑補(bǔ)充至同一體積,顯色后測定各份溶液的吸光度,然后以吸光度與相應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再依據(jù)供試品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其相應(yīng)的濃度,并求出其含量。

留意事項(xiàng)試驗(yàn)中所用的量瓶和移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正、洗凈后使用。

使用的石英吸取池必需潔凈。

當(dāng)吸取池中裝入同一溶劑,在規(guī)定波長測定各吸取池的透光率,%以下者可配對使用,否則必需加以校正。

取吸取池時(shí),手指拿毛玻璃面的兩側(cè)。

裝樣品溶液的體積以池體積的45為度,使用揮發(fā)性溶液時(shí)應(yīng)加益,透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭潔凈,檢視應(yīng)無殘留溶劑,為防止溶劑揮發(fā)后溶質(zhì)殘留在池子的透光面,可先用醮有空白溶劑的擦鏡紙擦拭,然后再用干擦鏡紙拭凈。

吸取池放入樣品室時(shí)應(yīng)留意每次放入方向一樣。

使用后用溶劑及水沖洗潔凈,晾干,防塵保存,吸取池如污染不易洗凈時(shí)可用硫酸發(fā)煙***3:11混合液稍加浸泡后,洗凈備用。

如用鉻酸鉀清潔液清洗時(shí),吸取池不宜在清潔液中長時(shí)間浸泡,否則清潔液中的鉻酸鉀結(jié)晶會(huì)損壞吸取池的光學(xué)外表,并應(yīng)充分用水沖洗,以防鉻酸鉀吸附于吸取池外表。

含有雜原子的有機(jī)溶劑,通常均具有很強(qiáng)的末端吸取。

因此,當(dāng)作溶劑使用時(shí),它們的使用范圍均不能小于截止使用波長。

例如甲醇、乙醇的截止使用波長為205。

另外,當(dāng)溶劑不純時(shí),也可能增加干擾吸取。

因此,在檢查所用的溶劑在供試品所用的波長四周是否符合要求,立刻溶劑置1石英吸取池中,以空氣為空白〔即空白光路中不置任何物質(zhì)〕測定其吸光度,溶劑和吸取池的吸光度應(yīng)符合表3規(guī)定。

表3以空氣為空白測定溶劑在不同波特長的吸光度的規(guī)定波長范圍〔〕220~240241~250251~300300以上吸光度≤≤≤≤,混合勻稱的同批溶劑。

稱量應(yīng)按藥典規(guī)定要求。

配制測定溶液時(shí)稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應(yīng)盡可能少,轉(zhuǎn)移稀釋時(shí)所取容積一般應(yīng)不少于5。

含量測定時(shí)供試品應(yīng)稱取2份,如為比照品比較法,比照品一般也應(yīng)稱取2份。

吸取系數(shù)檢查也應(yīng)稱取供試品2份,平行操作,每份結(jié)果對平均值的偏差應(yīng)在%以內(nèi)。

作鑒別或檢查可取樣品1份。

供試品溶液的濃度,,~,吸光度讀數(shù)在此范圍誤差較小,并應(yīng)結(jié)合所用儀器吸光度線性范圍,配制相宜的讀數(shù)濃度。

選用儀器的狹縫譜帶寬度應(yīng)小于供試品吸取帶半高寬的10%,否則測得的吸光度值會(huì)偏低,或以減小狹縫寬度時(shí)供試品溶液的吸光度不再增加為準(zhǔn),對于《中國藥典》紫外分光光度法測定的大局部品種,可以使用2縫寬,但當(dāng)吸取帶的半高寬小于20時(shí),則應(yīng)使用較窄的狹縫,例如青霉素鉀及鈉的吸光度檢查需用縫寬或更窄,否則其264的吸光度會(huì)偏低。

測定時(shí)除另有規(guī)定者外,應(yīng)在規(guī)定的吸取峰2處,再測幾點(diǎn)的吸光度,以核對供試品的吸取峰位置是否正確,并以吸光度最大的波長作為測定波長,除另有規(guī)定外吸光度最大波長應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長2以內(nèi),否則應(yīng)考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長的精確?????度。

用于制劑含量測定時(shí),應(yīng)留意供試液與比照液的值是否全都,如值對吸取有影響,則應(yīng)調(diào)溶液的值全都后再測定吸光度。

結(jié)果計(jì)算比照品比較法可依據(jù)供試品溶液及比照品溶液的吸光度與比照品溶液的濃度以正比法算出供試品溶液的濃度,再計(jì)算含量。

式中:—為吸光度值;—為測試液濃度〔以計(jì)〕。

吸取系數(shù)法《中國藥典》規(guī)定的吸取系數(shù),系指,即在指定波長時(shí),光路長度為1,試樣濃度換算為1%時(shí)的吸光度值,故應(yīng)先求被測樣品的}盞值,再