植物總rna提取方法的研究進(jìn)展

植物總rna提取方法的研究進(jìn)展

火炬松是中國(guó)重要的速生工業(yè)材料樹(shù)種之一。它現(xiàn)在得到了廣泛的推廣，構(gòu)成了中國(guó)重要的工業(yè)材料資源（劉等人，1999）。除用材外松脂產(chǎn)品也具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益,廣泛應(yīng)用于造紙、橡膠、醫(yī)藥和飲食等多個(gè)領(lǐng)域(宋湛謙,2002)。為了提高火炬松用材材性和松脂產(chǎn)量,對(duì)火炬松進(jìn)行分子水平的機(jī)理研究已成為必然。提取高質(zhì)量的RNA是對(duì)植物組織進(jìn)行分子水平研究的必要前提(王杰等,2015),Northern雜交、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、純化mRNA、RT-PCR/原位雜交等都需要高質(zhì)量的RNA(杜運(yùn)鵬等,2010)。但是許多植物組織中富含酚類(lèi)化合物、多糖、蛋白質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等,為高質(zhì)量RNA的提取帶來(lái)一定程度的困難,此外DNA污染、內(nèi)源和外源RNAase的存在都是影響RNA提取效果的主要因素。對(duì)于針葉樹(shù)種尤其是松科植物高質(zhì)量的RNA提取難度大,TRIzol法(Simmsetal.,1993)和CTAB法(張玉剛等,2005)等均是常見(jiàn)的RNA提取方法。但是針對(duì)火炬松韌皮部或針葉總RNA的提取且有很好提取效果的方法仍然較為少見(jiàn),這主要是因?yàn)榛鹁嫠身g皮部和針葉中含有較多難以去除的多糖和多酚類(lèi)物質(zhì)。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,目前越來(lái)越多的動(dòng)植物RNA快速提取試劑盒被開(kāi)發(fā)出來(lái),試劑盒的主要特點(diǎn)是,方便、簡(jiǎn)單、快捷。但是不同植物組織有不同的優(yōu)化RNA提取方法。為了篩選出較適合火炬松總RNA的提取方法,本研究中我們根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料和理論知識(shí)在常規(guī)CTAB法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了稍加改變,得到了改良的CTAB法,并選用了市場(chǎng)上常用5種RNA提取試劑盒,對(duì)火炬松的韌皮部和松針進(jìn)行RNA提取,并對(duì)提取的RNA進(jìn)行了純度和完整性的檢測(cè)及分析。1結(jié)果與分析1.1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)取3μLRNA樣品結(jié)合1μL染料在1.2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示:EASYspinPlusPlantRNAKit和Magzol1.2不同方法提取堅(jiān)韌皮和針葉總數(shù)的純度和濃度280、260和230下的吸光值分別代表了蛋白和分類(lèi)物質(zhì)、核酸和碳水化合物的含量,純度高的RNA樣品的OD2植物rna的提取提取到高質(zhì)量的火炬松總RNA是后續(xù)對(duì)火炬松開(kāi)展分子生物學(xué)方面研究的必要前提?；鹁嫠勺畲蟮奶攸c(diǎn)就是含有較多難以去除的多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物,這為火炬松高質(zhì)量RNA的提取帶來(lái)一定的困難。RNA提取試劑盒因其操作簡(jiǎn)單、快捷的特點(diǎn),并且在許多植物組織中已成功分離出高質(zhì)量的RNA(趙錦等,2009)而被應(yīng)用的越來(lái)越廣泛。但不同植物組織細(xì)胞內(nèi)外成分具有復(fù)雜性和多樣性,而且非常適合火炬松針葉和韌皮部總RNA提取的試劑盒也鮮為報(bào)道。對(duì)于富含多糖和多酚類(lèi)的植物材料,用CTAB作為陽(yáng)離子表面活性劑成分已在許多種植物材料中分離出高質(zhì)量的RNA(杜運(yùn)鵬等,2010)。利用CTAB-Licl法從百合花瓣中提取到了高質(zhì)量的RNA(郝福玲等,2005),利用改良CTAB法從百合葉片中提取到了質(zhì)量高,產(chǎn)量大,完整性好的RNA(尹慧等,2008)。由于成年火炬松在松針取材上存在一定的困難,本研究中以火炬松針葉和韌皮部為材料,較為常見(jiàn)的5種植物RNA提取試劑盒和根據(jù)火炬松自身特性,并在前人CTAB法的基礎(chǔ)上做了適當(dāng)改動(dòng)的改良CTAB法為實(shí)驗(yàn)方法。改良CTAB法的基本特點(diǎn)為:裂解液中2%的聚乙烯吡咯烷酮能抑制酚類(lèi)物質(zhì)的氧化,3%的β-巰基乙醇可以還原被氧化的酚類(lèi)物質(zhì)(Bahlouletal.,1993);高濃度的Licl(10mol/L)選擇性沉淀RNA、多次氯仿/異戊醇的抽提和利用-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀RNA這些措施均能有效的去除多糖;此外SSTE能有效的去除殘留的Licl以防影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所選的植物RNA提取試劑盒中ColumnPlantRNAout2.0和HiPurePlantRNAMiniKit具有較好的提取效果,且韌皮部的提取效果比針葉更好。改良CTAB法在火炬松針葉和韌皮部中均能提取到質(zhì)量高、完整性好的RNA。說(shuō)明改良CTAB法比植物RNA提取試劑盒更適合火炬松總RNA的提取。本研究為火炬松RNA提取方法或RNA提取試劑盒的選擇提供了基礎(chǔ),與此同時(shí)也為其他松杉類(lèi)植物RNA提取方法的選擇上帶來(lái)了參考價(jià)值。3材料和方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1植物園樣品的提取成年火炬松韌皮部和針葉均采于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)植物園,所取樣品放入free-RNAase的50mL離心管中并迅速放入液氮盒中保存,之后轉(zhuǎn)入超低溫冰箱中保存。3.1.2depc/rohs/gca水的配制CTAB提取液是參考王暑輝等(2012),按2%CTAB、2%PVP-40、100mM/LTris-HCl(pH8.0濃鹽酸調(diào)pH)、25mmol/LEDTA(NaoH調(diào)pH8.0)、2.0mmol/LNaCl、0.5g/L亞精胺的比例配置,配置所用水均為用DEPC處理過(guò)的水。SSTE溶液按1.0mol/LNaCl、0.5%SDS、10mmol/LTris-HCl(pH8.01mmol/LEDTA(pH8.0),ColumnPlantRNAout2.0提取試劑盒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司、E.Z.N.A.3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1測(cè)試盒法試劑盒法均按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,其中MagZol3.2.2g火炬松離心研磨法sste改良CTAB法是參考Chang等(1993),Bekesiova等(1999),王杰等(2015)的操作方法,并作適當(dāng)改動(dòng)而成的,具體操作步驟如下:(1)取2mL的free-RNAase的離心管,加入1mL的CTAB裂解液和30μLβ-巰基乙醇;(2)用無(wú)水乙醇灼燒研缽滅菌后,加液氮冷卻,稱(chēng)取100mg火炬松韌皮部或針葉于研缽中快速充分研磨,將研磨物轉(zhuǎn)入2mL離心管中,渦旋混勻30s,65℃水浴15min;(3)13000rpm,4℃離心10min。取上清轉(zhuǎn)入另一干凈的1.5mL離心管中(盡量避免吸取到沉淀物,可放棄一小部分上清不取);(4)加入和上清等體積的氯仿:異戊醇(24:1),渦旋混勻30s;(5)13000rpm,4℃離心5min,取上清。加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)渦旋混勻30s;(6)13000rpm,4℃離心5min,取上清,加入1/4體積的10MLiCl溶液。4℃沉淀RNA(一般為9~12h);(7)13000rpm,4℃離心10min,棄上清,加入300μLSSTE溶解沉淀;(8)加等體積氯仿:異戊醇(24:1),渦旋混勻30s,13000rpm,4℃離心5min,取上清;(9)加入兩倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇-70℃放置20min。13000rpm,4℃離心8min,