火炬松成熟合子胚體胚培養(yǎng)研究

火炬松成熟合子胚體胚培養(yǎng)研究

體育速度是最理想的，具有自動化快速繁殖的優(yōu)勢，是一種更精確、更快速繁殖的系統(tǒng)育種和快速繁殖技術(shù)。1材料和方法1.1種子和貯藏方法以火炬松成熟合子胚為外植體?；鹁嫠沙墒旆N子由美國弗吉尼亞州理工學(xué)院及州立大學(xué)提供,參試家系為AL615*658,采收的種子貯藏在5℃的冰箱備用。1.2菌水沖洗和水浸成熟種子用自來水沖洗3次后,在超凈工作臺上用70%~75%的酒精進行表面消毒60s,用無菌水沖洗2次后,再用2%的次氯酸鈉溶液中振蕩消毒3min,用無菌水沖洗4次以上,每次沖洗時間不少于2min,消毒好的種子用常溫無菌水浸種24h備用。在超凈工作臺上,將浸泡過的種子剝?nèi)シN殼后,按上述無菌消毒程序再重復(fù)消毒1次,但次氯酸鈉溶液消毒時間不超過1min。1.3不同植物生長添加劑的組合對體育細胞的誘導(dǎo)作用參照火炬松未成熟合子胚體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基1.4合子胚接種培養(yǎng)基方式一:完整的成熟合子直接接入培養(yǎng)基;方式二:合子胚與胚乳剝離后,合子胚連同胚乳一起接入培養(yǎng)基,并保持胚根端與胚乳接觸;方式三:以方式二將合子胚接入培養(yǎng)基,再添加胚乳提取液0.05mL。胚乳提取液的制備方法參照Egertsdotter1.5對比試驗試驗試驗以千粒重29.77g與43.03g的2種規(guī)格的種子(經(jīng)人工挑選)進行對比試驗。以接種方式二將外植體接入AL-TX、TX-TX、LP-TX、LP-LP培養(yǎng)基,在(23±2)℃培養(yǎng)室,全程無菌、全暗培養(yǎng)40d后調(diào)查誘導(dǎo)率。1.6培養(yǎng)條件觀察和增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的胚性胚柄細胞團(ESM)及時轉(zhuǎn)接到維持培養(yǎng)基(即原誘導(dǎo)培養(yǎng)基),觀察ESM在維持培養(yǎng)過程的形態(tài)變化,統(tǒng)計存活率。連續(xù)3代的維持培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基(試驗以植物生長調(diào)節(jié)劑減半AL-TX為增殖培養(yǎng)基),每20d為1個繼代周期。培養(yǎng)室溫度為(23±2)℃,采用全程無菌、全暗培養(yǎng)方式。1.7體育研究參照花旗松體胚成熟培養(yǎng)程序2結(jié)果與分析2.1體胚的早期解剖采用接種方式二,即合子胚與胚乳剝離后,一同接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)14~21d,部分合子胚子葉轉(zhuǎn)綠,子葉和上胚軸間產(chǎn)生白色、透明小突起(圖1A);35~42d后,在解剖鏡下可見早期體胚的胚頭(圖1B)。大部分合子胚下胚軸與胚根間產(chǎn)生淡黃色、松散型、顆粒狀非胚性、非器官性愈傷組織火炬松成熟合子胚體胚直接源于合子胚上胚軸與子葉之間,形成的胚性胚柄細胞團由早期體胚組成,沒有經(jīng)過愈傷組織階段。唐巍等2.2體胚獲得體胚由表3可見,3種接種方式中,僅有第2種方式獲得體胚;由此推斷合子胚連同胚乳接種有利于體胚的誘導(dǎo),這可能與胚乳能提供體胚誘導(dǎo)的某些活性物質(zhì)有關(guān)2.3體胚的平均誘導(dǎo)率由表4可見,種子千粒重為43.03g的合子胚在4種培養(yǎng)基上均獲得體胚,種子千粒重大,其平均誘導(dǎo)率越高。這可能是顆粒大的種子,合子胚大且胚乳更為飽滿,在離體培養(yǎng)時能提供體胚發(fā)生所需的有效成分。說明挑選種粒飽滿的種胚為外植體有助于提高體胚誘導(dǎo)率。2.4sm失去胚性將具有典型絲狀結(jié)構(gòu)的ESM轉(zhuǎn)入原誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行胚性維持培養(yǎng),經(jīng)過3次連續(xù)轉(zhuǎn)代后,僅有35%的ESM保持其典型的絲狀結(jié)構(gòu);25%的ESM失去胚性,解剖鏡下可見培養(yǎng)物表面僅有少量體胚,培養(yǎng)物多為游離單細胞或團狀多細胞(似“原胚”結(jié)構(gòu));而約有40%ESM或褐化死亡,或失去胚性。將ESM轉(zhuǎn)入植物生長調(diào)節(jié)劑減半的AL-TX培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng),在連續(xù)1a的繼代增殖培養(yǎng)過程中,大多數(shù)ESM失去胚性或增殖能力,或生長速率衰退而死亡,僅獲得2個具有長期繼代增殖能力的胚性細胞系A(chǔ)L-225、AL-273(圖1C、圖1D)。2.5體胚發(fā)育情況不同胚性細胞系體胚質(zhì)量影響體胚的發(fā)育和成熟。AL-273細胞系為后期原胚細胞團組成,轉(zhuǎn)入6種成熟培養(yǎng)基均未見體胚的發(fā)育成熟。胚性細胞系A(chǔ)L-225為典型的ESM結(jié)構(gòu),由發(fā)育1階段體胚組成,轉(zhuǎn)入6種成熟培養(yǎng)基后各有不同的成熟反應(yīng)(表5、圖2);在1和3號培養(yǎng)基中,體胚發(fā)育為第3~5階段,添加AC促進體胚的進一步發(fā)育,但未添加AC的3號培養(yǎng)基體胚質(zhì)量最高,形狀更似合子胚。未添加PEG的2號培養(yǎng)基,體胚發(fā)育相對遲緩,主要以第2階段的體胚為主。PCIB是抗生長素抑制劑,能抑制增殖和促進高質(zhì)量成熟胚的發(fā)育。而本試驗中,添加PCIB(4號培養(yǎng)基)促進體胚胚頭增大,而胚柄細胞呈游離態(tài),體胚逐漸死亡。這可能是樹種、基因型不同內(nèi)源生長素濃度水平導(dǎo)致的差異。未添加ABA的5號培養(yǎng)基體胚呈畸形態(tài)。未經(jīng)無植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)階段,ESM繼續(xù)增殖,體胚未見進一步發(fā)育。盡管1、3號培養(yǎng)基獲得了發(fā)育3~5階段的體胚,但繼續(xù)培養(yǎng)均未能獲得子葉胚和完全成熟的體胚。這是否與胚性細胞系的基因型有關(guān),有待于進一步研究。3體胚誘導(dǎo)體胚發(fā)生的重復(fù)性差火炬松成熟合子胚體胚誘導(dǎo)率較非成熟合子胚誘導(dǎo)率低。未成熟合子胚體胚誘導(dǎo)率高達40%火炬松成熟合子胚誘導(dǎo)體胚發(fā)生可重復(fù)性差。一方面與外植體基因型有關(guān),另一