22.1 微生物的實驗室培養(yǎng)公開課一等獎?wù)n件省賽課獲獎?wù)n件

課題一微生物試驗室培養(yǎng)專項二微生物培養(yǎng)與應(yīng)用第1頁微生物11.特點：構(gòu)造都相稱簡單,個體多數(shù)十分微小，一般要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有甚至沒有細(xì)胞構(gòu)造，且體內(nèi)一般不具有葉綠素，不能進行光合作用。一、基礎(chǔ)知識第2頁酵母菌放線菌第3頁上圖都是某些常見微生物，微生物是構(gòu)造簡單、形體微小單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒有細(xì)胞構(gòu)造低等生物，與人類關(guān)系密切。人工培養(yǎng)和分離，使得我們更深入結(jié)識微生物。今天我們就來學(xué)習(xí)如何培養(yǎng)和分離大腸桿菌！第4頁2.微生物包括五類病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動物第5頁培養(yǎng)基2培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工辦法配制而成，專供微生物生長繁殖使用混合營養(yǎng)液。第6頁固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基1.培養(yǎng)基類型成份區(qū)分：瓊脂第7頁培養(yǎng)基類型液體培養(yǎng)基：增菌、工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基：純化（分離），判定、活菌計數(shù)、保藏菌種半固體培養(yǎng)基：動力檢測第8頁按照培養(yǎng)基用途分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基成份分合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基將某種類微生物從混雜微生物群體中分離出來用于鑒別不一樣類型微生物培養(yǎng)基第9頁※幾個選擇培養(yǎng)基①加入青霉素培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真菌②不加氮源無氮培養(yǎng)基分離固氮菌③不加含碳有機物無碳培養(yǎng)基分離自養(yǎng)型微生物第10頁2.培養(yǎng)基成份①一般營養(yǎng)物質(zhì)：水、碳源、氮源、無機鹽、生長因子(即細(xì)菌生長必需，而本身不能合成化合物)②滿足其他物質(zhì)，如對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣、二氧化碳、滲入壓等要求第11頁⑴碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機氮源：有機氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等具有C、H、O、N化合物既能夠作為碳源，又能夠作為氮源，如氨基酸等?；境煞荩禾荚?、氮源、水、無機鹽第12頁配制標(biāo)準(zhǔn)(1)目明確：(2)營養(yǎng)全面、濃度合適、百分比恰當(dāng)(3)合適pH值：有機碳源異養(yǎng)型：根據(jù)微生物種類、培養(yǎng)目標(biāo)選擇原料自養(yǎng)型：不加有機碳加入緩沖劑細(xì)菌偏堿，真菌偏酸（CO2碳源）生產(chǎn)科研微生物生長不可缺乏微量有機物如：維生素、氨基酸、堿基等(4)特殊營養(yǎng)：3.培養(yǎng)基配制第13頁無菌技術(shù)3無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物操作中，所有避免雜菌污染辦法。無菌操作是培養(yǎng)微生物成功關(guān)鍵！避免外來雜菌污染無菌意義：第14頁（1）試驗操作空間、操作者衣著和手，進行清潔和消毒。（2）培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。（3）為避免周圍環(huán)境中微生物污染，試驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行。（4）試驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理材料用具與周圍物品相接觸。1無菌范圍第15頁（1）消毒定義：2.消毒與滅菌概念及二者區(qū)分（2）滅菌定義：是指殺滅物體表面或內(nèi)部部分病原微生物（不包括芽孢和孢子）辦法。是指殺滅或清除環(huán)境中一切微生物（包括芽胞、孢子）辦法。第16頁3.常用消毒辦法1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒第17頁a.灼燒滅菌；常用于接種環(huán)、接種針、試管口等滅菌。4.常用滅菌辦法第18頁b.干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。常用于玻璃器皿和金屬器具。c.高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.常用于培養(yǎng)基、無菌水等滅菌。第19頁制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1倒平板操作2接種大腸桿菌3大腸桿菌分離后保存4二、試驗操作第20頁制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1計算－稱量－溶化－滅菌－倒平板1.計算第21頁2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少許水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂、攪拌→補水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：調(diào)整PH至偏堿性，加棉塞、包牛皮紙、橡皮筋勒緊。培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌，培養(yǎng)皿干熱滅菌第22頁1.將培養(yǎng)皿放在火焰旁桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基錐形瓶，左手撥出棉塞。12342.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。3.用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口縫隙，右手將錐形瓶中培養(yǎng)基(約10～20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上皿蓋。4.等候平板冷卻凝固（約需5～

10min）。然后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。倒平板操作2第23頁1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么措施來估計培養(yǎng)基溫度？用手觸摸，剛才不燙手時2.為何需要使錐形瓶瓶口通過火焰？灼燒滅菌，避免瓶口微生物污染思考：第24頁避免皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。3.為何將平板倒置？4.在倒平板過程中，不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？最佳不要用該培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物。第25頁5.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？答：無菌檢查：將滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫室中培養(yǎng)24～48小時，觀測是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。第26頁1.平板劃線法：分區(qū)劃線法連續(xù)劃線法聚集菌群連續(xù)劃線稀釋分散單個細(xì)胞菌落生長繁殖微生物接種3（1）平板劃線法原理第27頁第28頁（2）平板劃線法步驟：①灼燒接種環(huán)；②接種環(huán)冷卻后，蘸取帶菌培養(yǎng)物；③在近火焰處，讓帶菌接種環(huán)在固體培養(yǎng)基上劃線。第29頁11.線條不重合22-3.從上次末端開始，交叉2~3條線344.最后劃線不能與第一區(qū)相連。第30頁（3）平板劃線法注意事項①接種環(huán)只蘸一次菌液，但要在培養(yǎng)基不一樣位置連續(xù)劃線數(shù)次。②劃線首尾不能相接。③劃線后，培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h。第31頁3個劃線平板1個不劃線平板（反復(fù)試驗）（空白對照）（4）培養(yǎng)放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h第32頁第一步灼燒接種環(huán)：避免接種環(huán)上也許存在微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)：為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留菌種；最后劃線結(jié)束后仍要灼燒接種環(huán)：能及時殺死接種環(huán)上殘留菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。1.為何在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為何？思考：第33頁2.在灼燒接種環(huán)之后，為何要等其冷卻后再進行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后劃線操作時，為何總是從上一次劃線末端開始劃線？劃線后，線條末端細(xì)菌數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線末端開始，能使細(xì)菌數(shù)目伴隨劃線次數(shù)增加而逐漸減少，最后能得到由單個細(xì)菌繁殖而來菌落。第34頁①菌液梯度稀釋：②涂布平板操作：(1)概念與原理：聚集微生物單個細(xì)胞菌液梯度稀釋菌落涂布平板(2)操作：生長繁殖2.稀釋涂布平板法第35頁稀釋涂布平板法①菌液梯度稀釋注意：移液管需要通過滅菌；試管口和移液管離火焰1～2cm處。第36頁②涂布平板操作第37頁各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h（3）培養(yǎng)第38頁大腸桿菌分離后保存41.臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2.長期保存：甘油冷凍管藏法1ml甘油＋1ml菌液－20℃第39頁（一）培養(yǎng)基制作是否合格假如未接種培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基制備是成功，不然需要重新制備。三、試驗操作成果評價第40頁（二）接種操作是否符合無菌要求假如培養(yǎng)基上生長菌落顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落特點，則說明接種操作是符合要求；假如培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作尚未達(dá)成要求，需要分析原因，再次練習(xí)。第41頁（三）是否進行了及時細(xì)致觀測與統(tǒng)計培養(yǎng)12h與24h后大腸桿菌菌落大小會有顯著不一樣，及時觀測統(tǒng)計同窗會發(fā)覺這一點，并能觀測到其他某些細(xì)微變化。這一步要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。第42頁微生物試驗室培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)無菌技術(shù)試驗室常用消毒辦法試驗室常用滅菌辦法制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板純化大腸桿菌平板劃線法稀釋涂布法成果分析與評價課題延伸【課堂小結(jié)】第43頁1