細(xì)胞全能性專題知識

第一節(jié)細(xì)胞全能性及其表示細(xì)胞全能性概述細(xì)胞脫分化細(xì)胞再分化細(xì)胞全能性專題知識第1頁細(xì)胞全能性----

一個細(xì)胞所含有產(chǎn)生完整生物個體固有能力。細(xì)胞全能性絕對性與相對性:

不是全部基因型全部細(xì)胞在任何條件下都含有良好培養(yǎng)反應(yīng);即使對于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞全能性也并不意味著任何細(xì)胞均能夠直接產(chǎn)生植物個體;動、植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)程度存在顯著差異。一.細(xì)胞全能性概述細(xì)胞全能性專題知識第2頁植物細(xì)胞按照分裂能力分為三類：第一類是一直保持分裂能力，從一個周期進(jìn)入另一個周期周期細(xì)胞。如莖尖、根尖及形成層細(xì)胞；第二類是永久失去分裂能力細(xì)胞，為終端分化細(xì)胞。如篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞；第三類是在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新開啟分裂Go細(xì)胞。表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞。細(xì)胞全能性專題知識第3頁一個植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。（引自Gautheret,1966）

細(xì)胞全能性專題知識第4頁植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)依據(jù)細(xì)胞類型不一樣從強(qiáng)到弱:

營養(yǎng)生長中心>形成層>薄壁細(xì)胞>厚壁細(xì)胞(木質(zhì)化細(xì)胞)>特化細(xì)胞(篩管、導(dǎo)管細(xì)胞)；依據(jù)細(xì)胞所處組織不一樣從強(qiáng)到弱為：頂端分生組織>居間分生組織>側(cè)生分生組織>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導(dǎo)組織>厚壁組織。細(xì)胞全能性專題知識第5頁細(xì)胞全能性脫分化再分化細(xì)胞分裂個體再生細(xì)胞全能性表示是經(jīng)過細(xì)胞脫分化和再分化實現(xiàn)，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表示前體，再分化是細(xì)胞全能性表示最終表示。細(xì)胞全能性專題知識第6頁二.細(xì)胞脫分化細(xì)胞生理與結(jié)構(gòu)改變細(xì)胞脫分化調(diào)控機(jī)理細(xì)胞分裂與愈傷組織形成細(xì)胞全能性專題知識第7頁培養(yǎng)條件下使一個已分化細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)過程就是細(xì)胞脫分化（dedifferentiation）。離體培養(yǎng)下，脫分化過程發(fā)生在第一次有絲分裂之前.靜止細(xì)胞開啟分裂是分化細(xì)胞成功脫分化主要標(biāo)志。細(xì)胞脫分化過程中生理和結(jié)構(gòu)改變細(xì)胞全能性專題知識第8頁薄壁細(xì)胞：

細(xì)胞核較小，核位于細(xì)胞邊緣，細(xì)胞中央有大液泡，細(xì)胞體內(nèi)核糖體密度較低，多聚核糖體數(shù)目較少，質(zhì)體為分化程度較高葉綠體、雜色體、白色體和淀粉體。脫分化細(xì)胞：

細(xì)胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失，核體積增加并逐步移位至細(xì)胞中央，細(xì)胞器增加。在這些改變中，液泡蛋白體出現(xiàn)和質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體被認(rèn)為是細(xì)胞脫分化重要特征。細(xì)胞全能性專題知識第9頁細(xì)胞脫分化調(diào)控機(jī)理細(xì)胞周期對脫分化調(diào)控

激素誘導(dǎo)表示基因與細(xì)胞脫分化PSK發(fā)覺及其對細(xì)胞脫分化影響細(xì)胞脫分化與染色體解凝聚環(huán)境原因作用細(xì)胞全能性專題知識第10頁1.損傷作用-----損傷細(xì)胞產(chǎn)生自溶物質(zhì)可能對脫分化早期誘導(dǎo)起作用。2光線----影響外植體最初分裂3.氧-----有利于脫分化細(xì)胞全能性專題知識第11頁細(xì)胞脫分化調(diào)控實質(zhì)即是G0期細(xì)胞回復(fù)到分裂周期調(diào)控過程

G1“限制點”G0期缺乏外界生長信號或一些必需營養(yǎng)成份細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和依賴周期蛋白激酶(CDK細(xì)胞全能性專題知識第12頁年度諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎取得者，美國科學(xué)家Hartwell與英國科學(xué)家Hunt和Nurse工作揭開了這一過程調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和依賴周期蛋白激酶(CDKcyclin-dependentkinase)是兩類主要調(diào)控分子。細(xì)胞周期運(yùn)行動力主要來自CDK，其活性則主要經(jīng)過cyclin調(diào)整和依賴周期蛋白抑制子（CKIcyclin-dependentkinaseinhibitor）負(fù)調(diào)整。細(xì)胞全能性專題知識第13頁植物激素是離體培養(yǎng)中所必需條件，所以與植物激素相關(guān)基因表示被認(rèn)為是開啟細(xì)胞脫分化關(guān)鍵。Takahashi等（1989）從一個葉肉原生質(zhì)體cDNA文庫中分離到一個2,4-D誘導(dǎo)表示基因，命名為par。par基因在細(xì)胞從G0期轉(zhuǎn)入S期早期開啟中含有功效性作用。Kyo等克隆了一組花粉富含硫蛋白(pollen-abundantphosphoproteins)基因NtEPa，NtEPb，NtEPc。其中NtEPc表示與花粉細(xì)胞脫分化轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞高度偶聯(lián)，認(rèn)為該基因參加花粉細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞脫分化過程但不參加細(xì)胞進(jìn)入分裂周期后調(diào)控過程。細(xì)胞全能性專題知識第14頁不一樣植物愈傷組織誘導(dǎo)對激素需求不一樣，普通分為四類：需生長素-----菊芋休眠塊莖需細(xì)胞分裂素----白蕪菁根需生長素、細(xì)胞分裂素---煙草髓、胡蘿卜根、馬鈴薯塊莖需復(fù)雜天然提取物----范圍較廣。細(xì)胞全能性專題知識第15頁Matsubayashi和Sakagami（1996）在石刁柏葉肉細(xì)胞低密度懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，首次分離到2個促分裂肽—phytosulfokine-α和β(PSKα,PSKβ)，檢測分析發(fā)覺，在同時有NAA和BA存在條件下，第一次細(xì)胞分裂發(fā)生在培養(yǎng)96小時，而培養(yǎng)48小時即可檢測到PSKα，在培養(yǎng)基沒有NAA和BA培養(yǎng)細(xì)胞中，檢測不到PSKα存在，同時細(xì)胞也停留在G0/G1期而不能開啟分裂，由此推測，PSKα可能介導(dǎo)了與生長素和細(xì)胞分裂素親密相關(guān)信號傳導(dǎo)路徑細(xì)胞全能性專題知識第16頁煙草葉肉細(xì)胞脫分化過程中染色體有2次解凝聚過程。第一次解凝聚發(fā)生在細(xì)胞壁酶解過程中第二次解凝聚發(fā)生在原生質(zhì)體在含有生長素和細(xì)胞分裂素培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時第二次解凝聚對于細(xì)胞進(jìn)入S期是十分主要，發(fā)生二次解凝聚細(xì)胞在培養(yǎng)72小時后即進(jìn)入S期，在不含植物激素培養(yǎng)基中細(xì)胞，染色體不發(fā)生第二次解凝聚，以后快速死亡。第一次染色體解凝聚是細(xì)胞脫分化轉(zhuǎn)換過程，經(jīng)過此過程細(xì)胞關(guān)閉分化狀態(tài)，而第二次解凝聚則是有絲分裂周期銜接過程。細(xì)胞全能性專題知識第17頁細(xì)胞脫分化與愈傷組織形成細(xì)胞脫分化是細(xì)胞狀態(tài)改變，但成功脫分化必定會造成細(xì)胞分裂，對于單個細(xì)胞而言，分化細(xì)胞開啟分裂顯然是發(fā)生在細(xì)胞完全脫分化之后細(xì)胞全能性專題知識第18頁*

脫分化與愈傷組織形成在性質(zhì)上是不能等同，脫分化是細(xì)胞生理狀態(tài)改變，而形成愈傷組織是離體培養(yǎng)中一個階段。

盡管細(xì)胞脫分化后進(jìn)入細(xì)胞分裂結(jié)果，在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但絕不是說全部細(xì)胞脫分化結(jié)果都必定形成愈傷組織，許多試驗表明，有些外植體細(xì)胞脫分化以后直接形成胚性細(xì)胞進(jìn)而形成體細(xì)胞胚。

細(xì)胞全能性專題知識第19頁愈傷組織內(nèi)細(xì)胞并不是均一未分化，即同一愈傷組織內(nèi)細(xì)胞之間其狀態(tài)存在一定差異，尤其是在組織器官培養(yǎng)時，往往出現(xiàn)部分細(xì)胞不完全脫分化現(xiàn)象，從而使其很輕易再分化再生植株，這對培養(yǎng)來說無疑是十分有利。細(xì)胞全能性專題知識第20頁從外植體到形成愈傷組織可分為三個階段：誘導(dǎo)期---靜止細(xì)胞準(zhǔn)備分裂，其長短各植物不一。誘導(dǎo)期需高生長素和低細(xì)胞分裂素。分裂期（增殖期）---細(xì)胞不停分裂，可進(jìn)行繼代培養(yǎng)，保持細(xì)胞分裂分化期---出現(xiàn)次生生長，愈傷組織長久不繼代培養(yǎng)，分化是不可防止。細(xì)胞全能性專題知識第21頁三.細(xì)胞再分化所謂細(xì)胞分化（Differentiation），是指造成細(xì)胞形成不一樣結(jié)構(gòu)，引發(fā)功效改變或潛在發(fā)育方式改變過程。一個細(xì)胞在不一樣發(fā)育階段上能夠有不一樣形態(tài)和機(jī)能，這是在時間上分化；同一個細(xì)胞后代，因為所處環(huán)境不一樣而能夠有相異形態(tài)和機(jī)能，這是在空間上分化。細(xì)胞全能性專題知識第22頁從分化遺傳控制角度講，細(xì)胞分化是各個處于不一樣時空條件下細(xì)胞，基因表示與修飾差異反應(yīng)，所以，分化也能夠說是相同基因型細(xì)胞因為基因選擇性表示所反應(yīng)各種不一樣表現(xiàn)型。在離體條件下，當(dāng)細(xì)胞脫分化以后，無序生長細(xì)胞及其愈傷組織要重新進(jìn)入有序生長進(jìn)而才能再生個體，所以，通常把離體培養(yǎng)下這一過程稱為再分化（redifferentiation）。細(xì)胞全能性專題知識第23頁細(xì)胞分化與基因組改變TE分化及其調(diào)控激素在細(xì)胞分化中作用極性與細(xì)胞分化細(xì)胞全能性專題知識第24頁染色體重復(fù)復(fù)制DNA差異擴(kuò)增基因重排基因表示產(chǎn)物及其調(diào)控與修飾是細(xì)胞分化本質(zhì)所在。越來越多研究顯示，細(xì)胞分化主要受基因在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，其中一些特異蛋白基因表示調(diào)整在細(xì)胞分化過程中起到了主要作用細(xì)胞分化中基因組改變細(xì)胞全能性專題知識第25頁極性（polarity）是植物細(xì)胞分化中一個基本現(xiàn)象。

所謂極性是指植物器官、組織、甚至單個細(xì)胞在不一樣軸向上存在某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上梯度差異。在很多情況下，細(xì)胞不均等分裂是是細(xì)胞極性建立標(biāo)志。極性與細(xì)胞分化細(xì)胞全能性專題知識第26頁Fucus合子細(xì)胞不均等分裂及其早期發(fā)育（引自Bouget等，1998）

極性建立與質(zhì)膜離子通道不對稱分布和細(xì)胞周質(zhì)微管重排相關(guān)細(xì)胞全能性專題知識第27頁通常把離體培養(yǎng)中TE（TEtrachearyelements）細(xì)胞出現(xiàn)作為組織分化標(biāo)志而極性建立似乎又是維管發(fā)生一個信號，極性建立后生長素按極性方向流動，造成TE細(xì)胞分化因為TE細(xì)胞在分化過程中含有細(xì)胞壁加厚，原生質(zhì)體自溶等輕易觀察細(xì)胞特征，從而又為植物細(xì)胞分化研究提供了模式體系TE形成與細(xì)胞分化細(xì)胞全能性專題知識第28頁百日草葉肉細(xì)胞向TE細(xì)胞分化主要調(diào)控過程（引自Fukuda，1997）

細(xì)胞全能性專題知識第29頁由百日草葉肉細(xì)胞分化形成TE細(xì)胞（引自Motose,）細(xì)胞全能性專題知識第30頁百日草葉肉細(xì)胞向TE分化過程中基因表示分析（引自Demura等，）細(xì)胞全能性專題知識第31頁激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化主要原因，其中生長素和細(xì)胞分裂素是兩類主要調(diào)控培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長和分化植物激素。另外，在有些試驗中也顯示，GA3、ABA、乙烯等也在細(xì)胞分化中起到一定調(diào)整作用。激素對細(xì)胞分化調(diào)控作用細(xì)胞全能性專題知識第32頁*在離體條件下，假如用生長素和細(xì)胞分裂素處理次序不一樣，其作用也不一樣。假如先用生長素處理，后用細(xì)胞分裂素處理，則有利于細(xì)胞分裂而不利于細(xì)胞分化；反之，則有利于細(xì)胞分化。假如二者同時處理，則可促使分化頻率提升。

生長素與細(xì)胞分裂素在細(xì)胞分化中協(xié)同調(diào)控作用。細(xì)胞全能性專題知識第33頁除了生長素和細(xì)胞分裂素外，赤霉酸（GA）、乙烯（EL）、脫落酸（ABA）、油菜素內(nèi)酯（BR）等植物激素在細(xì)胞分化中作用也有報道。越來越多研究顯示，植物激素對細(xì)胞生長與分化調(diào)控是一個復(fù)雜級聯(lián)調(diào)控過程，離體培養(yǎng)條件下，因為外植體細(xì)胞所處生理狀態(tài)不一樣以及內(nèi)源激素水平差異，試圖尋找外源激素水平在分化中作用共同模式可能是很困難。細(xì)胞全能性專題知識第34頁細(xì)胞脫分化和再分化是離體培養(yǎng)過程中細(xì)胞全能性表現(xiàn)基本過程，了解這一過程調(diào)控機(jī)理，最終是為再生個體奠定基礎(chǔ)。生物個體形成是經(jīng)過形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）實現(xiàn)，建立在離體培養(yǎng)基礎(chǔ)上形態(tài)發(fā)生稱之為體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生（somaticmorphogenesis）。體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生過程及其調(diào)控機(jī)理是細(xì)胞工程學(xué)研究關(guān)鍵內(nèi)容。

細(xì)胞全能性專題知識第35頁*第二節(jié)器官發(fā)生

植物離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官過程。細(xì)胞全能性專題知識第36頁器官發(fā)生方式器官發(fā)生過程起始材料對器官分化影響激素對器官分化調(diào)控光照對器官分化影響器官分化基因調(diào)控細(xì)胞全能性專題知識第37頁先芽后根

先根后芽

根芽同時發(fā)生

器官發(fā)生方式普通而言，先芽后根，如先根則抑制芽形成。細(xì)胞全能性專題知識第38頁經(jīng)過愈傷組織器官發(fā)生不經(jīng)過愈傷組織器官發(fā)生器官發(fā)生過程細(xì)胞全能性專題知識第39頁經(jīng)過愈傷組織器官發(fā)生過程愈傷組織形成生長中心形成器官原基及器官形成細(xì)胞全能性專題知識第40頁愈傷組織形成細(xì)胞全能性專題知識第41頁生長中心形成，含有單向極性，與胚狀體不一樣細(xì)胞全能性專題知識第42頁芽形成細(xì)胞全能性專題知識第43頁芽外生芽內(nèi)生細(xì)胞全能性專題知識第44頁不經(jīng)過愈傷組織器官發(fā)生在有些情況下，外植體不經(jīng)過經(jīng)典愈傷組織即可形成器官原基，這一路徑有兩種情況：一是外植體中已存在器官原基，深入培養(yǎng)即形成對應(yīng)組織器官進(jìn)而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)。另一個情況是外植體一些部位細(xì)胞在重新分裂后，直接形成份生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基。這種不經(jīng)過愈傷組織直接發(fā)生器官路徑在以品種繁殖為目標(biāo)離體培養(yǎng)中含有主要實踐意義。細(xì)胞全能性專題知識第45頁a.細(xì)胞第一次平周分裂b.生長中心形成c.原初分生組織d.芽原基形成細(xì)胞全能性專題知識第46頁外植體類型母體植物遺傳基礎(chǔ)起始材料對器官分化影響細(xì)胞全能性專題知識第47頁總體上說，被子植物比裸子植物輕易培養(yǎng)，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培養(yǎng)成功報道最多。通常情況下，自然繁殖以無性繁殖為主植物在培養(yǎng)條件下也有較強(qiáng)器官分化能力同種植物不一樣品種（基因型）培養(yǎng)效果含有較大差異已是不爭事實?；蛐蛯τ谂囵B(yǎng)反應(yīng)差異，器官分化能力差異大于愈傷組織誘導(dǎo)差異。細(xì)胞全能性專題知識第48頁外植體對誘導(dǎo)反應(yīng)及其再生能力影響體還現(xiàn)在生理狀態(tài)上起源于生長活躍或生長潛力大組織、器官細(xì)胞更有利于培養(yǎng)對于多年生植物而言，以幼嫩組織為材料不論是誘導(dǎo)還是分化均較輕易。一、二年生無性繁殖植物取材則可塑性較大，但仍以自然繁殖器官為外植體更易成功。細(xì)胞全能性專題知識第49頁外植體選取合理是否，不但影響培養(yǎng)難易，而且有時甚至影響分化程度和器官類型。花芽營養(yǎng)芽，花芽營養(yǎng)芽TranThanhVan等，1974細(xì)胞全能性專題知識第50頁激素對器官發(fā)生影響離體培養(yǎng)下器官分化在大多數(shù)情況下是經(jīng)過外源提供適宜植物激素而實現(xiàn)。在眾多植物激素中，生長素與細(xì)胞分裂素是2類主要植物激素，在離體器官分化調(diào)控中占有主導(dǎo)地位。GA3,PSK在器官分化中也含有一定調(diào)控作用。細(xì)胞全能性專題知識第51頁生長素/細(xì)胞分裂素高有利于根分化生長素/細(xì)胞分裂素低有利于芽分化生長素與細(xì)胞分裂素必須協(xié)調(diào)使用才能再生正常個體（引自Pierik,1987）細(xì)胞全能性專題知識第52頁離體培養(yǎng)中，外源激素在細(xì)胞內(nèi)吸收和代謝影響到激素活性從而影響其培養(yǎng)效果。外源細(xì)胞分裂素被外植體吸收后，在細(xì)胞內(nèi)被修飾和轉(zhuǎn)化形成活化形式和鈍化形式。普通認(rèn)為，細(xì)胞分裂素自由堿基形式是活性形式，而核苷形式為鈍化形式。經(jīng)過細(xì)胞分裂素氧化酶對側(cè)鏈修飾可能是植物組織細(xì)胞中降低細(xì)胞分裂素活性主要機(jī)制，在煙草細(xì)胞培養(yǎng)中使用二氫玉米素比使用玉米素更為有效，可能與二氫玉米素核糖苷不是細(xì)胞分裂素氧化酶底物相關(guān)。細(xì)胞全能性專題知識第53頁生長素進(jìn)入細(xì)胞后，一部分以游離狀態(tài)存在，另一部分則與氨基酸結(jié)合形成生長素－氨基酸復(fù)合體。

與生長素結(jié)合氨基酸主要為天門冬氨酸，也有谷氨酸。

2,4-D、NAA、IAA是慣用3種生長素。

Ribnicky等（1996）研究顯示，因為生長素種類不一樣，形成生長素－氨基酸復(fù)合體量含有顯著差異，從而亦表現(xiàn)出作為外源生長素在培養(yǎng)效果上差異。細(xì)胞全能性專題知識第54頁外源生長素在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)細(xì)胞中總量和游離生長素含量*培養(yǎng)時間外源生長素濃度生長素游離形式（ng/gFW）總濃度（ng/gFW）1周2,4-DNAA[2H4]IAA23,247.4±3,912.799.3±9.730.3±3.521,979.4±2,526.31,776.7±50.17,557.0±279.04周2,4-DNAA[2H4]IAA20,003.8±4,365.964.8±17.53.4±1.433,119.4±3,835.01,637.0±509.8763.5±420.0*引自Ribnicky等1996。細(xì)胞全能性專題知識第55頁光照是離體培養(yǎng)中比較復(fù)雜調(diào)整因子，光照時間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對器官分化都有影響。光照對器官分化影響細(xì)胞全能性專題知識第56頁連續(xù)光照有利于培養(yǎng)細(xì)胞維管組織形成，而一定晝夜光照周期則有利于極性建立和形態(tài)發(fā)生。培養(yǎng)條件下，光照作用更大程度上是調(diào)整細(xì)胞分化狀態(tài)，而不是合成光合產(chǎn)物。光照對器官發(fā)生調(diào)整可能與調(diào)整培養(yǎng)物內(nèi)源激素平衡相關(guān)，光照還可能影響生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)整生長素極性運(yùn)輸，從而引發(fā)器官分化。光質(zhì)對器官分化影響可能與光受體準(zhǔn)確調(diào)整系統(tǒng)相關(guān)。細(xì)胞全能性專題知識第57頁基因調(diào)控

homebox細(xì)胞周期基因

其它細(xì)胞全能性專題知識第58頁Kn1（KNOTTED1）是從玉米中判定出第一個植物homebox基因，Kn1-likehomebox（knox）基因又可分為2組（classI和classII），classIIknox在各種分化組織器官中均表示，而classIknox只在分生組織中表示。在玉米和大麥離體培養(yǎng)中，大量不定芽生成部位也檢測到KN1基因大量表示。在一些轉(zhuǎn)Kn1相同基因地研究中表明，轉(zhuǎn)基因植株能大量產(chǎn)生復(fù)合芽以及不定分生組織。STM（SHOOTMERISTEMLESS）基因以及它們直系同源（orthologues）基因均參加了莖尖分生組織分化調(diào)控。在轉(zhuǎn)Homeobox相關(guān)基因煙草植物中還檢測分析到赤霉素含量降低和生長素含量上升內(nèi)源激素改變，這也暗示，Homeobox基因可能經(jīng)過一些調(diào)整因子（如激素）介導(dǎo)調(diào)控器官分化。細(xì)胞全能性專題知識第59頁植物編碼細(xì)胞周期依賴性激酶基因cdc2在離體培養(yǎng)中，調(diào)整細(xì)胞進(jìn)入分裂狀態(tài)過程起著關(guān)鍵性作用，在玉米和大麥離體培養(yǎng)中，cdc2表示高峰發(fā)生在不定芽形成過程中，在培養(yǎng)早期表示量較少，同時，該基因表示部位處于分生組織外層細(xì)胞，所以認(rèn)為，cdc2基因?qū)Ψ稚M織形成和維持分生組織狀態(tài)都有主要作用。細(xì)胞全能性專題知識第60頁Banno等（）從擬南芥根培養(yǎng)再生芽體系中克隆了一個增強(qiáng)芽再生能力基因ESR1，將該基因與35S開啟子連接轉(zhuǎn)化擬南芥，在有細(xì)胞分裂素存在情況下轉(zhuǎn)基因外植體能夠顯著提升不定芽分化率。而生長素不能誘導(dǎo)該基因表示，一樣也不能提升不定芽分化頻率。細(xì)胞全能性專題知識第61頁從煙草溫度突變體中判定出3個與離體器官發(fā)生相關(guān)基因SRD1、SRD2和SRD3，當(dāng)它們發(fā)生隱形突變時，在離體培養(yǎng)中表現(xiàn)出器官發(fā)生在不一樣時期受阻，3個基因均定位于擬南芥I號染色體上。（引自Cary等，）細(xì)胞全能性專題知識第62頁細(xì)胞全能性專題知識第63頁*

第三節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生

離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成胚類似物（不論培養(yǎng)細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。

細(xì)胞全能性專題知識第64頁這一定義有以下幾方面界定：其一，體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)分于無融合生殖胚；其二，體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)分于合子胚；其三，體細(xì)胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，以區(qū)分與離體培中器官發(fā)生形成個體路徑。其四，胚狀體最根本特征是含有兩極性，即在發(fā)育早期階段能從相反兩個方向分化出莖端和根端，可一次再生完整植株。而不定根和不定芽都是單極性，必須先誘導(dǎo)芽再生根。細(xì)胞全能性專題知識第65頁體細(xì)胞胚形成體細(xì)胞胚發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點影響體細(xì)胞胚發(fā)生原因體細(xì)胞胚發(fā)生生化與分子基礎(chǔ)細(xì)胞全能性專題知識第66頁直接路徑一.體細(xì)胞胚形成間接路徑細(xì)胞全能性專題知識第67頁體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生1.誘導(dǎo)階段2.胚胎發(fā)育階段（引自Chen等,1999）

細(xì)胞全能性專題知識第68頁經(jīng)過愈傷組織體細(xì)胞胚形成經(jīng)過懸浮細(xì)胞體細(xì)胞胚形成間接發(fā)生細(xì)胞全能性專題知識第69頁誘導(dǎo)愈傷組織形成愈傷組織胚性化球性胚形成子葉胚期（引自Lin等，）

細(xì)胞全能性專題知識第70頁愈傷組織胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)胚性細(xì)胞團(tuán)球性胚形成成熟子葉胚（引自Choi等，1997）

細(xì)胞全能性專題知識第71頁體細(xì)胞胚發(fā)育細(xì)胞學(xué)特點體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)特點二.體細(xì)胞胚發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點細(xì)胞全能性專題知識第72頁類似于植物合子胚發(fā)育早期原胚發(fā)生胚胎細(xì)胞發(fā)生球形胚形成完整胚結(jié)構(gòu)形成（引自Figueroa等，）

細(xì)胞全能性專題知識第73頁類似于動物胚胎早期發(fā)育胚胎細(xì)胞發(fā)生發(fā)育早期2次均等分裂胚結(jié)構(gòu)形成（引自Fifueroa等，）

細(xì)胞全能性專題知識第74頁結(jié)構(gòu)特點與器官發(fā)生形成個體路徑相比，體細(xì)胞胚發(fā)育再生植株有兩個顯著特點：一是體細(xì)胞胚含有雙極性（doulblepolarity）；二是體細(xì)胞胚形成后與母體維管束系統(tǒng)連系較少，即出現(xiàn)所謂生理隔離（physiologicalisolation）現(xiàn)象。細(xì)胞全能性專題知識第75頁*合子胚：發(fā)育早期含有顯著胚柄，

體細(xì)胞胚:沒有真正胚柄,只有類似胚柄結(jié)構(gòu)。

合子胚:子葉是相當(dāng)規(guī)范

體細(xì)胞胚:子葉常不規(guī)范。體積顯著小于合子胚，

合子胚在胚胎發(fā)育完全進(jìn)入子葉期胚以后，經(jīng)過一系列物質(zhì)積累和脫水就進(jìn)入休眠，

體細(xì)胞胚沒有顯著脫水干燥過程,在心形期以后各個階段均可直接形成植株。細(xì)胞全能性專題知識第76頁三.影響體細(xì)胞胚發(fā)生原因激素調(diào)控作用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件影響基因型影響細(xì)胞全能性專題知識第77頁2,4-D是應(yīng)用最為廣泛生長素。2,4-D應(yīng)用有著規(guī)律性改變，首先是在較高濃度下誘導(dǎo)胚性細(xì)胞形成，然后在降低2,4-D濃度下產(chǎn)生早期胚胎，普通在球形胚形成后，除去生長素有利于體細(xì)胞胚繼續(xù)發(fā)育?，F(xiàn)有研究證實，在球形胚期形成生長素極性運(yùn)輸對于體細(xì)胞胚深入發(fā)育尤為主要，假如球形胚阻斷生長素極性運(yùn)輸或改變生長素極性運(yùn)輸方向，均會影響體細(xì)胞胚正常發(fā)育。激素調(diào)控作用細(xì)胞全能性專題知識第78頁細(xì)胞分裂素對體細(xì)胞胚發(fā)育影響研究報道較少，但幾乎全部相關(guān)體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)基配方中，都有細(xì)胞分裂素配合使用。細(xì)胞分裂素在促進(jìn)細(xì)胞分裂，維持細(xì)胞活躍生長中含有主要生理功效，而完成體細(xì)胞胚胎發(fā)育細(xì)胞分裂是基本前體，當(dāng)胚胎結(jié)構(gòu)建立后，細(xì)胞分裂素對于維持分生組織正常發(fā)育含有主要作用。細(xì)胞全能性專題知識第79頁培養(yǎng)基中氮源亦會顯著影響離體條件下胚胎發(fā)生，體細(xì)胞胚產(chǎn)生要求培養(yǎng)基中含有一定濃度還原態(tài)氮。Vesco和Guerra在Feijoa植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)試驗也證實，培養(yǎng)基氮源影響體細(xì)胞胚發(fā)生頻率。在NH4+和NO3-（15:34）培養(yǎng)基中，每個外植體體細(xì)胞胚可達(dá)10個以上，而培養(yǎng)基只有NH4+或NO3-時，體細(xì)胞胚發(fā)生頻率很低。一些氨基酸能夠代替還原態(tài)氮作用，上述Feijoa植物體細(xì)胞胚培養(yǎng)體系，在只含NO3-培養(yǎng)基中，假如加入4mM甘氨酸，能夠顯著提升體細(xì)胞胚發(fā)生頻率。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件影響細(xì)胞全能性專題知識第80頁一些體細(xì)胞胚規(guī)模生產(chǎn)模式試驗還發(fā)覺，球形胚形成后，假如降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，能夠顯著促進(jìn)體細(xì)胞胚深入發(fā)育。Choi等（）在西伯利亞人參（E.senticosus）培養(yǎng)中證實，在體細(xì)胞胚培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可顯著提升體細(xì)胞胚成苗率。在一些試驗中還發(fā)覺，體細(xì)胞胚發(fā)育后期降低蔗糖濃度，也有利于胚繼續(xù)發(fā)育和提升體細(xì)胞胚成苗率。細(xì)胞全能性專題知識第81頁Lee等（）在改進(jìn)胡蘿卜體細(xì)胞胚生產(chǎn)程序試驗中，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入降低濃度MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，結(jié)果顯示，當(dāng)胚性愈傷組織形成后，在只含1/2MS無機(jī)鹽濃度培養(yǎng)基中，體細(xì)胞胚形成能夠比在MS培養(yǎng)基中高3－4倍。細(xì)胞全能性專題知識第82頁Choi等（）在西伯利亞人參（E.senticosus）培養(yǎng)中也證實，在體細(xì)胞胚培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可顯著提升體細(xì)胞胚成苗率。細(xì)胞全能性專題知識第83頁馬鈴薯不一樣基因型體細(xì)胞胚形成能力比較（引自Seabrook和Douglass，）基因型影響細(xì)胞全能性專題知識第84頁內(nèi)源激素調(diào)控基因特異蛋白四.體細(xì)胞胚胎發(fā)生生化與分子基礎(chǔ)細(xì)胞全能性專題知識第85頁外源生長素對體細(xì)胞胚產(chǎn)生和發(fā)育調(diào)控是經(jīng)過調(diào)整內(nèi)源激素合成、代謝、極性運(yùn)輸和平衡而起作用。Ribnicky等在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)中證實，體細(xì)胞胚形成早期細(xì)胞內(nèi)含有較高濃度游離態(tài)生長素，外源2,4-D和NAA比IAA誘導(dǎo)體細(xì)胞胚效果好，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)早期，細(xì)胞內(nèi)高濃度游離生長素是必要條件，直接添加外源IAA對其合成有反饋抑制，從而也影響體細(xì)胞胚形成，而2,4-D對IAA合成不存在反饋抑制，其結(jié)果也提升了體細(xì)胞胚發(fā)生頻率。水稻胚性細(xì)胞誘導(dǎo)也證實，高濃度2,4-D引誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)IAA含量升高，當(dāng)加入外源IAA或阻止細(xì)胞內(nèi)IAA滲出而提升細(xì)胞內(nèi)IAA含量時，均可促進(jìn)胚性愈傷組織形成。細(xì)胞全能性專題知識第86頁胡蘿卜胚發(fā)育過程中內(nèi)源IAA改變發(fā)育時期胚大?。é蘭）IAA濃度（ng/gFW）自由態(tài)結(jié)合肽總含量受精前子房受精前子房受精后子房受精后子房球形胚晚期/心形胚早期魚雷形胚早期魚雷形胚晚期

75-12575-125125-225400-500900-110015±428±5608±69504±522060±69624±527±42257±4241962±5634986±5951063±4827490±3440824±386796±2922272±4131990±4835594±5821567±4639550±4126848±392823±289（引自Ribnichy等）

細(xì)胞全能性專題知識第87頁生長素不但影響體細(xì)胞胚早期發(fā)生，同時也影響體細(xì)胞胚后期發(fā)育。生長素對體細(xì)胞胚后期發(fā)育影響是經(jīng)過極性運(yùn)輸實現(xiàn)。在合子胚發(fā)育中，這種極性運(yùn)輸嚴(yán)重影響胚形態(tài)建立。Liu等（1993）利用擬南芥幼胚培養(yǎng)體系，揭示了生長素極性運(yùn)輸由球形胚期得軸向?qū)ΨQ轉(zhuǎn)向心形胚期兩側(cè)對稱過程，假如這一過程受阻，則造成子葉異常發(fā)育成筒狀子葉，而不是正常2個子葉。在生長素極性運(yùn)輸突變體pin1中證實了上述結(jié)果，已克隆pin同源基因研究顯示，生長素極性運(yùn)輸及其對胚胎發(fā)育調(diào)控，是一系列胚胎發(fā)育相關(guān)基因有序表示到結(jié)果。細(xì)胞全能性專題知識第88頁相關(guān)體細(xì)胞胚形成中蛋白質(zhì)含量和組分改變，盡管不一樣研究在絕對含量上不盡相同，但總體趨勢均表現(xiàn)出體細(xì)胞胚形成過程中水溶性蛋白顯著增加。李中奎等（1993）比較水稻胚性與非胚性愈傷組織蛋白質(zhì)含量改變顯示，兩種愈傷組織蛋白質(zhì)含量差異主要表現(xiàn)為胚性愈傷組織水溶性和鹽溶性蛋白高于非胚性愈傷組織，而醇溶性蛋白則低于非胚性愈傷組織。特異蛋白細(xì)胞全能性專題知識第89頁阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs）是植物中廣泛存在糖蛋白，大多數(shù)AGPs存在有Ala-Hyp重復(fù)序列或類似重復(fù)序列，暗示AGPs可能作為調(diào)控蛋白調(diào)控一些基因轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞中，AGPs主要分布在細(xì)胞壁和質(zhì)膜上，利用一系列單克隆抗體已判定出一些與特殊發(fā)育相關(guān)和特殊組織相關(guān)AGPs，其中與單克隆抗體JIM8抗體結(jié)合AGPs在油菜中主要存在性細(xì)胞中、胚胎發(fā)育早期胚柄中。在胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)育中，這種抗體檢測AGPs存在于胚性細(xì)胞和早期體細(xì)胞胚中，在非胚性細(xì)胞中沒有AGPs，假如在一些非胚性懸浮細(xì)胞系中加入這類AGPs，則可使其恢復(fù)胚胎發(fā)生能力，顯示AGPs在植物體細(xì)胞胚發(fā)生過程中起到了調(diào)控作用。特異蛋白細(xì)胞全能性專題知識第90頁近年來研究發(fā)覺，一些病程相關(guān)蛋白可能也與體細(xì)胞胚形成相關(guān)。vanHengel（1998）在胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞衍生原生質(zhì)體培養(yǎng)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚過程中，伴隨體細(xì)胞胚形成在培養(yǎng)基中檢測到幾丁酯酶（chitinases）和AGPs積累；Dubois等（1991）在菊芋體細(xì)胞胚誘導(dǎo)中發(fā)覺，β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanases）與愈