酶工程酶制劑制備

酶工程酶制劑制備酶工程酶制劑制備第1頁

——（細(xì)胞破碎）

——發(fā)酵液預(yù)處理

——酶液脫色

——酶蛋白初步純化與濃縮

——（酶蛋白提純與精制）

——酶制劑成形。CH4.1酶制劑工業(yè)提取方法酶工程酶制劑制備第2頁注意事項(xiàng)

基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)：預(yù)防生物分子變性、降解1．控制適當(dāng)pH2．控制低溫3．注意提取過程中溶液環(huán)境4．預(yù)防提純過程中丟失一些輔助因子或亞基酶工程酶制劑制備第3頁CH4.1酶制劑工業(yè)提取方法

1細(xì)胞破碎方法對(duì)于胞內(nèi)酶提取與制備，首先要把細(xì)胞破碎，使局限在細(xì)胞內(nèi)酶蛋白游離出來，常見破碎方法有以下幾個(gè)：

1.1機(jī)械破碎法：1.2物理破碎法：1.3化學(xué)方法：①機(jī)械搗碎法：10000轉(zhuǎn)/分。②研磨法：只適合于試驗(yàn)室小規(guī)模操作。③勻漿法：細(xì)胞破碎程度較高，規(guī)模小。①溫差破碎法：②超聲波（>20kHz）裂解法：15-25kHz，100-150W，0-10℃，3-10min；

當(dāng)前有效化學(xué)方法主要是加入表面活性劑法常見有：特里頓X-100和吐溫（Tween），其主要是破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加膜通透性。此法在試驗(yàn)室和生產(chǎn)上已成功應(yīng)用

酶工程酶制劑制備第4頁CH4.1酶制劑工業(yè)提取方法

2發(fā)酵液預(yù)處理2.1發(fā)酵液絮凝發(fā)酵液首先要進(jìn)行過濾除菌，在發(fā)酵液中，由菌體自溶產(chǎn)生細(xì)胞碎片、核酸、雜蛋白等大分子物質(zhì)，使得發(fā)酵液極難過濾；在過濾前必須進(jìn)行絮凝處理。

發(fā)酵液預(yù)處理常見方法主要是在發(fā)酵液中加入絮凝劑，常見絮凝劑有：聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）磺化聚苯乙烯（PolystyreneSulfonate）；絮凝劑加入，主要有以下三方面作用：①改變發(fā)酵液中懸浮粒子物理特征，如加大粒子大小，提升粒子硬度等；②使一些可溶性膠體物質(zhì)變成不溶性沉淀粒子；③降低發(fā)酵液黏度。

2.2酶液脫色這一步驟可依據(jù)酶制劑要求而定，普通工業(yè)酶制劑允許含有起源中色素，所以就不脫色；對(duì)于醫(yī)用酶制劑、分析用酶等必須進(jìn)行脫色處理；當(dāng)前大個(gè)別工業(yè)酶制劑都要進(jìn)行脫色處理過程。常見脫色劑有活性炭和離子交換樹脂?；钚蕴课椒?，操作效率較高，脫色較徹底，但在脫色同時(shí)，也有個(gè)別酶蛋白被吸附掉了；離子交換樹脂基礎(chǔ)上在脫色同時(shí)，不吸附酶蛋白。

我國(guó)生產(chǎn)了一個(gè)脫色專用樹脂：通用１號(hào)脫色樹脂。在弱酸性條件下，其吸附色素，而在堿性條件下便釋放色素。樹脂再生方便，再生條件是：先用５％NaOH洗脫色素，待色素洗脫潔凈后，用蒸餾水洗到中性，再用5%HCl（二倍樹脂床體積）中和樹脂，再用蒸餾水洗到pH5.0-5.5為止。酶工程酶制劑制備第5頁CH4.1酶制劑工業(yè)提取方法

3酶蛋白初步純化與濃縮

3.1鹽析法[1]鹽析基礎(chǔ)原理：蛋白質(zhì)在水中溶解度與其所帶凈電荷多少呈正相關(guān)，即蛋白質(zhì)極性越強(qiáng)，其溶解度越大，溶液中離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分，從而減弱蛋白質(zhì)水合程度，降低其溶解度；另首先，液相中離子電荷個(gè)別地中和蛋白質(zhì)分子上電荷，使其凈電荷降低或凈電荷消失，促使蛋白質(zhì)析出；另外，溶液中鹽離子引發(fā)水分子極化和定向排列降低水分活度；以上三方面作用，使可溶性蛋白在水溶液中析出。

在鹽溶液里，蛋白質(zhì)溶解度對(duì)數(shù)值與溶液里離子強(qiáng)度成線性關(guān)系，大家總結(jié)了以下經(jīng)驗(yàn)公式：

logS=β-Ks.μS:Protein溶解度g/l；β為溶液離子強(qiáng)度為零時(shí)logS，

β值受蛋白質(zhì)性質(zhì)、鹽離子種類、溶液溫度和pH值影響；

Ks為鹽析常數(shù)，因蛋白質(zhì)而性質(zhì)和鹽離子種類不一樣而不一樣；μ為溶液離子強(qiáng)度。

[2]鹽析基礎(chǔ)方法：蛋白質(zhì)鹽析方法主要有以下兩種：

Ks鹽析法：即蛋白質(zhì)溶液pH值和溫度固定不變，改變?nèi)芤蝴}濃度（離子強(qiáng)度），以到達(dá)沉淀蛋白作用；此法常見鹽是硫酸銨。

β鹽析法：是在一定離子強(qiáng)度下，改變?nèi)芤簆H值和溫度，以到達(dá)蛋白沉淀目標(biāo)。在實(shí)際工作中，常見是Ks鹽析法，利用不一樣飽和度(NH4)2SO4濃度，這么不一樣蛋白質(zhì)析出沉淀(NH4)2SO4

濃度不一樣；經(jīng)過這種方法可將個(gè)別雜蛋白分離出去，到達(dá)濃縮酶蛋白目標(biāo)。[3]鹽析曲線：按鹽析經(jīng)驗(yàn)公式，以中性鹽濃度對(duì)酶蛋白溶解度作圖，得一條以下曲線：鹽濃度（飽和度）酶蛋白溶解度鹽溶效應(yīng)：[4]詳細(xì)操作方法：飽和溶液法:干粉加入法:[5]影響鹽析原因：

溫度：

pH：[6]鹽析后脫鹽處理透析法：凝膠過濾法：酶工程酶制劑制備第6頁調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表酶工程酶制劑制備第7頁CH4.1酶制劑工業(yè)提取方法

3酶蛋白初步純化與濃縮3.2有機(jī)溶劑沉淀法

除用鹽析法沉淀酶蛋白外，還能夠用有機(jī)溶劑沉淀酶蛋白，當(dāng)前選取有機(jī)溶劑主要有丙酮和乙醇，而且丙酮沉淀效果比乙醇好，但丙酮價(jià)格高，蒸餾回收困難，所以當(dāng)前多采取乙醇作沉淀劑。

沉淀酶蛋白所需乙醇濃度受很多原因影響，溶液離子強(qiáng)度、溫度、pH值等都影響蛋白質(zhì)析出，低濃度鹽離子有促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解作用，即所謂鹽溶效應(yīng)；所以當(dāng)溶液中有低濃度鹽離子時(shí)，乙醇濃度要增加；溫度升高蛋白質(zhì)溶解度增加，沉淀酶蛋白需要乙醇濃度增加；pH值影響因不一樣蛋白質(zhì)而不一樣，普通情況下，當(dāng)溶液pH值與酶蛋白等電點(diǎn)一致時(shí)，需要乙醇濃度最低，偏離酶蛋白等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，酶蛋白所帶電荷越多，蛋白質(zhì)溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇濃度越高。普通作為沉淀劑乙醇濃度是95%，沉淀不一樣酶蛋白需要乙醇量稍有差異。如沉淀枯草桿菌淀粉酶發(fā)酵液時(shí)，要求乙醇濃度為：每體積發(fā)酵液加0.2—0.8體積乙醇；當(dāng)沉淀蛋白酶時(shí)，加0.8—1.1體積乙醇沉淀出主要是中性蛋白酶，加1.1—1.4體積乙醇時(shí)，沉淀出主要是堿性蛋白酶。對(duì)于每一個(gè)酶蛋白沉淀要求乙醇適宜濃度需要試驗(yàn)確定。酶工程酶制劑制備第8頁幾個(gè)主要沉淀方法比較酶工程酶制劑制備第9頁CH4.1酶制劑工業(yè)提取方法

3酶蛋白初步純化與濃縮3.3

噴霧干燥法

此法是利用噴霧干燥技術(shù)，直接將液態(tài)酶濃縮成固體酶制劑，此法生產(chǎn)效率較高，工藝過程簡(jiǎn)單，但此法在生產(chǎn)應(yīng)用上有一定不足，在噴霧干燥時(shí)，需要一定溫度，在噴霧塔里面進(jìn)如一定溫度熱空氣，對(duì)于那些對(duì)熱不穩(wěn)定酶蛋白不宜使用，現(xiàn)用在生產(chǎn)主要是生產(chǎn)α-淀粉酶。3.4膜分離技術(shù)除上述經(jīng)典濃縮方法外，當(dāng)前膜技術(shù)發(fā)展已應(yīng)用到酶蛋白濃縮和分離上來了，膜分離技術(shù)是以一定孔徑高分子膜作為過濾介質(zhì)，將不一樣大小、不一樣性狀、物質(zhì)顆?；虼蠓肿舆M(jìn)行分離技術(shù)。膜分離技術(shù)所使用膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素、賽璐玢、尼龍等高分子聚合物制成高分子膜。在膜分離過程中，膜作用是有選擇性地小于其孔徑顆粒經(jīng)過，將大顆粒截留，依據(jù)欲分離物質(zhì)顆粒大小，選擇不一樣孔徑膜。

依據(jù)物質(zhì)顆粒經(jīng)過膜原理及和推進(jìn)力不一樣，膜分離技術(shù)可分為以下三種：①加壓膜分離加壓膜分離是以膜兩側(cè)流體靜壓差為動(dòng)力，推進(jìn)小于膜孔徑顆粒經(jīng)過膜孔，大于孔徑顆粒被截留。依據(jù)膜孔徑大小范圍又分為超濾、微濾和反滲透三種。

超濾：即超出濾，本技術(shù)過濾截留顆粒直徑在20—A（0.2μm)相當(dāng)于分子量1000—5×105Da,而且有各種規(guī)格供選取。此法主要用于酶蛋白濃縮和個(gè)別純化分離，另外，在生化藥業(yè)也常被采取。此技術(shù)采取濾膜是由丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素、尼龍等高分子聚合物制成高分子膜，膜由兩層組成，分表層和基層，表層是濾膜有效層，其厚度為0.1—5μmμm，孔徑大小有各種規(guī)格，現(xiàn)有20—A系列產(chǎn)品銷售；基層為支持層，主要負(fù)責(zé)膜強(qiáng)度，其厚度為200—250μm含有堅(jiān)韌強(qiáng)度。影響超濾原因：膜過濾效果用膜流率來表示，即每平方厘米膜每分鐘濾過流體量，以ml./cm2.min表示，影響流率主要原因有膜孔徑大小、顆粒性狀、溶液黏度、流體靜壓。依據(jù)上述影響原因，可在一定范圍內(nèi)增加流體靜壓（普通控制在50—700kPa)、適當(dāng)提升溶液溫度、增加溶液攪拌述度都可在一定程度上提升膜流率。超濾技術(shù)在當(dāng)前不論是試驗(yàn)室研究還是酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用都非常廣泛，其操作簡(jiǎn)單，工作效率高，但對(duì)于那些有小分子輔酶酶制劑不宜采取此技術(shù)。

微濾：又稱微孔過濾，其孔徑較超濾膜孔徑大，普通在0.2—2.0μm范圍，主要用于過濾去除細(xì)菌及其它顯微鏡下可見顆粒物質(zhì)，此法在酶蛋白濃縮和分離方面不用，主要勇于礦泉水、無菌水、軟飲料生產(chǎn)方面除菌和除去不溶性顆粒物質(zhì)。

反滲透：反滲透膜孔徑最小，普通在20A，截留分子量為1000D主要用于分離各種離子和小分子物質(zhì)，此技術(shù)主要用于生產(chǎn)純水，海水淡化等。

②電場(chǎng)膜分離：將膜分離裝置置于電場(chǎng)下，被分離物質(zhì)在電場(chǎng)作用下，借助電場(chǎng)力作為推進(jìn)力，以到達(dá)分離目標(biāo)。利用電場(chǎng)膜分離物質(zhì)，必須具備一個(gè)基礎(chǔ)條件，那就是其必須是帶電粒子，假如其不帶電荷，或其靜電荷為零，這么粒子就不宜用此法分離。常見有以下兩種方法：

電滲析：在一個(gè)電滲槽內(nèi)，用兩塊半通透膜隔成三個(gè)室，中間室裝待分離液，兩側(cè)室裝水或緩沖液，并裝有電極，接通電源后，帶正電荷粒子向負(fù)極滲透，而帶負(fù)電荷粒子向正極滲透，從而到達(dá)分離目標(biāo)。此法多用于酶液脫鹽，去除雜質(zhì)等。

離子交換膜電滲析：其裝置與電荷風(fēng)析一致，只是所用膜較為特殊，兩塊膜上帶有帶電基團(tuán)，且電性相反，使得帶相同電荷粒子不能靠近膜，不致于影響膜通透性。其應(yīng)用范圍與電滲析一致，當(dāng)溶液濃度較高時(shí)，此法工作效率更高。③擴(kuò)散膜分離：擴(kuò)散膜分離主要是指透析方法，將酶溶液裝在由擴(kuò)散膜制成透析袋中，再將透析袋置于擴(kuò)散介質(zhì)（緩沖液）中，溶液中小分子就經(jīng)過膜擴(kuò)散出來，大分子被截留在袋內(nèi)。此法主要用于沒蛋白脫鹽；另外此法還可用于酶蛋白濃縮，當(dāng)濃縮酶蛋白時(shí)，是用高濃度吸水性較強(qiáng)擴(kuò)散介質(zhì)，常見有甘油、聚乙二醇（粉劑）等。酶工程酶制劑制備第10頁CH4-2酶蛋白提純與精制

普通情況下，工業(yè)上用大多是經(jīng)過初步提純和濃縮即可制備成酶制劑；對(duì)于多數(shù)醫(yī)用酶制劑或分析用酶制劑或生化試劑等，則需要進(jìn)行高度提純和精制；另外對(duì)于開發(fā)出新酶制劑，在投入規(guī)?；a(chǎn)前，為研究其各種酶蛋白特征和酶學(xué)特征，也需要將酶深入提純和精制。

酶蛋白提純經(jīng)典程序包含：離子交換層析——分子篩過濾層析——電泳檢測(cè)純度（必要時(shí)可進(jìn)行制備電泳分離）酶工程酶制劑制備第11頁各類層析原理和載體類別分離原理基質(zhì)或載體吸附層析化學(xué)、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中溶解效應(yīng)纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析

分子篩效應(yīng)排阻效應(yīng)sepharose、sephadex離子交換層析離子基團(tuán)交換反應(yīng)離子交換樹脂、纖維素、葡聚糖親和層析

分離物與配體之間有帶配基sepharose

特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點(diǎn)和離子交換作用多緩沖交換劑（與帶有各種電荷基團(tuán)配體相偶聯(lián)

sepharose6B）酶工程酶制劑制備第12頁CH4-2酶蛋白提純與精制

1離子交換層析法

（1）離子交換劑：離子交換劑是借酯化、氧化或醚化等化學(xué)反應(yīng)，在瓊脂糖、纖維素或凝膠分子上一些極性基團(tuán)，經(jīng)過極性基團(tuán)靜電吸附作用，對(duì)極性大分子進(jìn)行分離。按離子交換劑上活性基團(tuán)性質(zhì)不一樣，可分為陽離子交換劑和陰離子交換劑兩種。陰離子交換劑：

當(dāng)離子交換劑攜帶陽性基團(tuán)，用來吸附陰離子時(shí)，交換劑稱為陰離子交換劑。

當(dāng)前常見陰離子交換劑有：

DEAE～纖維素（二乙基氨基乙基纖維素）

DEAE～纖維素適宜用來分離分子量在10,000-100,000或以上蛋白質(zhì)，其穩(wěn)定性好，裝柱后，在洗脫過程中，柱床體積基礎(chǔ)保持不變，交換容量大，每克交換劑可吸附0.1—1.1毫克酶蛋白。

DEAE～SephadexA50

DEAE～SephadexA50交換容量更大，（5.0毫克/克交換劑），但其有一最大不足，就是在洗脫過程中，伴隨離子強(qiáng)度增加柱床體積變小，影響分離效果。

AE～纖維素（氨基乙基纖維素）陽離子交換劑：

陽離子交換劑有：

CM～纖維素（CM－C，羧甲基纖維素）。弱酸性陽離子交換劑。磷酸纖維素（P－C）

中酸性離子交換劑。酶工程酶制劑制備第13頁常見陽離子交換劑

離子交換劑可電離基團(tuán)可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)CM-纖維素（弱酸型）羧甲基P-纖維素（中強(qiáng)弱酸型）磷酸基SE-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺乙基SP-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺丙基酶工程酶制劑制備第14頁常見陰離子交換劑

AE-纖維素（弱堿型）氨基乙基離子交換劑可電離基團(tuán)可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)PAB-纖維素（弱堿型）對(duì)氨基苯甲酸DEAE-纖維素二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基DEAE-纖維素（強(qiáng)堿型）三乙基氨基乙基QAE-纖維素（強(qiáng)堿型）二乙基（2-羥丙基）-氨基乙基（中弱堿型）（中弱堿型）酶工程酶制劑制備第15頁CH4-2酶蛋白提純與精制

1離子交換層析法（2）離子交換分離酶蛋白基礎(chǔ)原理：

普通情況下，酶蛋白等電點(diǎn)在pH7以下，所以在偏堿性溶液中，酶蛋白帶負(fù)電荷，所以多用陰離子交換劑；（有些酶蛋白等

電點(diǎn)較高，能夠?qū)⑵渲糜谄嵝匀芤褐校@么酶蛋白就帶正電荷，分離純化時(shí)應(yīng)選取陽離子交換劑）。在同一pH條件下，因?yàn)椴灰粯拥鞍踪|(zhì)所帶電荷不一樣，其與交換劑親和力不一樣，經(jīng)過梯度增加洗脫劑離子強(qiáng)度，按蛋白質(zhì)與交換劑親和力由小到大，依次被洗脫下來，到達(dá)分離目標(biāo)。酶工程酶制劑制備第16頁離子交換層析原理示意圖

蛋白質(zhì)濃度洗脫體積帶正電荷蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)搜集樣品管搜集樣品管帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)混合物玻璃柱帶正電荷蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)帶正電荷蛋白質(zhì)搜集樣品管NaClNaCl梯度酶工程酶制劑制備第17頁CH4-2酶蛋白提純與精制

1離子交換層析法

離子交換拄層析基礎(chǔ)程序及關(guān)鍵點(diǎn)：（以DEAE～纖維素為例）

①離子交換劑處理：首先將DEAE～纖維素用蒸餾水浸泡溶漲，然后按：0.5N鹽酸處理30分鐘以上（不停攪拌）→蒸餾水重復(fù)洗滌致中性→0.5N氫氧化鈉處理30分鐘（不停攪拌）→蒸餾水洗滌致中性。

②洗脫液pH確實(shí)定：采取pH梯度測(cè)定。按10％交換當(dāng)量加入離子交換劑和酶蛋白振蕩保溫20－30min靜止后，測(cè)定上清夜酶活力到?jīng)]有酶活力測(cè)出試管pH＋1，即為離子交換洗脫液最適pHpH1pH2pH3pH6pH5pH4pH7④平衡：裝柱后，用洗脫液進(jìn)行平衡過夜，流述稍大于洗脫流述，使流出緩沖液pH與流入相同。⑤上樣和平衡：為到達(dá)良好分離效果，上樣量普通為其交換容量10—20%，樣品pH值和離子強(qiáng)度應(yīng)與洗脫液一致。上樣后用洗脫Buffer平衡。洗脫曲線：⑦分部搜集：利用自動(dòng)分部搜集器搜集。⑥洗脫：上樣后，首先用平衡洗脫液洗脫，主要是洗脫下那些與交換劑結(jié)協(xié)力很小或不結(jié)合雜蛋白；然后，經(jīng)過改變洗脫液離子強(qiáng)度進(jìn)行梯度洗脫梯度洗脫公式為：

Ｃ=C2－(C2－C1)(1－v/V)A2/A1C2：洗脫液極限離子濃度；C1：初始離子濃度；

v：洗脫液流出體積；V：貯液室和混合室總體積；A2：貯液室截面積；A1：混合室截面積；

當(dāng)A2/A1等于1時(shí)，上述公式代表一個(gè)直線梯度改變；當(dāng)小于1時(shí)，為凹形梯度改變；當(dāng)大于1時(shí)，為凸形梯度改變。

③裝柱：將交換劑攪拌懸浮起來，抽氣處理，然后用傾倒法裝柱。(8)搜集與濃縮凝膠顆粒蛋白質(zhì)混合物大分子小分子儲(chǔ)液瓶混合瓶層析柱磁力攪拌器洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度簡(jiǎn)單型梯度混合器梯度洗脫曲線洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度儲(chǔ)液瓶混合瓶復(fù)合型梯度混合器梯度洗脫曲線凸形線形凹形酶工程酶制劑制備第18頁CH4-2酶蛋白提純與精制

2分子篩層析法（1）分子篩層析法基礎(chǔ)原理

凝膠過濾法是以不一樣蛋白質(zhì)分子量大小差異來將不一樣蛋白質(zhì)分開方法。最常見凝膠是葡聚糖凝膠（Sephadex),是由葡聚糖和3-1,2環(huán)氧化丙烷（交聯(lián)劑）相互交聯(lián)而成中央帶有微孔球狀凝膠顆粒，依據(jù)凝膠分子交聯(lián)程度不一樣，共有SephadexG10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等8種型號(hào)，G50以下為硬膠，G75以上為軟膠。G10交聯(lián)度最高，分子內(nèi)網(wǎng)孔最??；G200交聯(lián)度最低，分子內(nèi)網(wǎng)孔最大。依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不一樣，在經(jīng)過層析柱時(shí)，走旅程不一樣，從而分開。

（2）凝膠選擇：

G25以下主要用于脫鹽和氨基酸，或用于分離分子量在5000以下小肽。

G50主要用于分離分子量1500—30000小分子蛋白。

G753000—80000G1004000—150000G1505000—300000G2005000—600000（3）凝膠溶脹：

凝膠規(guī)格融脹體積（ml/g)時(shí)間/h.20C時(shí)間/h.90-100CG102－331G152.5-3.531G254-631G509-1131G7512-15243G10015-20723G15020-30725G20030-40725

(4)裝柱：裝柱前必須進(jìn)行凝膠脫氣處理，裝柱要求同離子交換層析

（5）裝柱效果檢測(cè)：

用帶有顏色大分子上樣，然后洗脫，檢測(cè)樣品走柱介面效果，常見藍(lán)色葡聚糖－。

（6）上樣：

和離子交換層析有根本不一樣。主要考慮上樣體積，普通控制在1％－10％。視詳細(xì)情況而定。

（7）洗脫

洗脫劑能夠用低濃度Buffer，也可用蒸餾水；在洗脫過程中，主要控制兩個(gè)參數(shù)：流速和有效操作壓凝膠規(guī)格流速（ml/h.cm2)有效操作壓(cm/H2O)G10G15G25G50G7577160G1005096G1502336G2001216（8）分部搜集：

基礎(chǔ)同離子交換層析(9)凝膠再生與保留：再生：用0.1mol鹽酸和0.1mol氫氧化鈉交替浸泡后，蒸餾水洗到中性，重新裝柱，可重復(fù)使用；保留：用0.1mol鹽酸和0.1mol氫氧化鈉交替浸泡后，蒸餾水洗到中性；50％乙醇——75％乙醇——95乙醇——冰箱保留。酶工程酶制劑制備第19頁蛋白質(zhì)Mr=49,000洗出液中蛋白質(zhì)濃度洗脫體積（mL）未知logMr洗脫體積與相對(duì)分子質(zhì)量關(guān)系

Andrews經(jīng)驗(yàn)公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“選擇性曲線”

G-200G-100logMrKav酶工程酶制劑制備第20頁吸附層析

（absorptionchromatography）

原理：載體：硅膠氧化鋁羥基磷石灰應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核苷酸等生化物質(zhì)以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)溶劑作流動(dòng)相。因?yàn)楦鞣N物質(zhì)極性不一樣，被吸附劑吸附程度和在流動(dòng)相中溶解度不一樣。層析時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相從固定相上流過時(shí)，各組分也就不一樣程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不一樣速度隨流動(dòng)相向前移動(dòng)。酶工程酶制劑制備第21頁分配層析

（distribuptionchromatography）

原理：載體：纖維素硅藻土硅膠應(yīng)用：各種生化物質(zhì)分離判定

分配層析實(shí)際上是一個(gè)連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙結(jié)合水為固定相，以水飽和有機(jī)溶劑為流動(dòng)相（展開劑）。當(dāng)流動(dòng)相沿濾紙經(jīng)過樣品點(diǎn)時(shí)，樣品點(diǎn)中溶質(zhì)在水和有機(jī)相中溶解度不一樣而不均勻地分配在兩相中，各種組分按其各自分配系數(shù)進(jìn)行不停分配，從而使物質(zhì)得到分離和純化。酶工程酶制劑制備第22頁逆流分溶原理示意圖物質(zhì)Y(Kd=1)分配情況溶劑A物質(zhì)Z(Kd=3)分配情況溶劑B總量總量總量總量總量總量平衡后轉(zhuǎn)移1轉(zhuǎn)移2轉(zhuǎn)移3分溶管號(hào)轉(zhuǎn)移4上相轉(zhuǎn)移下相轉(zhuǎn)移上相轉(zhuǎn)移管中蛋白質(zhì)總量物質(zhì)Y物質(zhì)Z分溶曲線管號(hào)有效分配系數(shù)（Keff）

某一物質(zhì)在A相中總量某一物質(zhì)在B相中總量酶工程酶制劑制備第23頁親和層析（affiuitychromatography）

應(yīng)用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶結(jié)構(gòu)與功效+待純化分子配體a.理論依據(jù)：待純化分子和配體間含有親和性+基質(zhì)b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純待純化分子原理：基質(zhì)纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、

sepharose、sephadex酶工程酶制劑制備第24頁親和層析原理示意圖

蛋白質(zhì)混合物配體與配體結(jié)合蛋白質(zhì)加入可溶性配基專一性結(jié)合蛋白質(zhì)沒有結(jié)合蛋白質(zhì)非專一性結(jié)合蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)濃度洗脫體積與配體專一性結(jié)合蛋白質(zhì)加入配基基質(zhì)酶工程酶制劑制備第25頁聚焦層析（Chromatofocusing）該法是在等電點(diǎn)聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來，其分離純化蛋白質(zhì)依據(jù)是等電點(diǎn)差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列過程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)先決條件，假如一個(gè)蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度層析柱上時(shí),因?yàn)橄疵撘哼B續(xù)流動(dòng)，蛋白質(zhì)將快速地遷移到與它等電點(diǎn)相同pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以遲緩速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出。在聚焦層析過程中,一個(gè)樣品分次加入時(shí)，只要先加入者還未洗出,而且有一定時(shí)間進(jìn)行聚焦,剩下樣品還能夠加到柱上,其聚焦過程都能順利完成。pH梯度溶液形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動(dòng)速率層析時(shí)聚焦效應(yīng)示意圖酶工程酶制劑制備第26頁幾個(gè)主要層析方法比較酶工程酶制劑制備第27頁

酶蛋白經(jīng)分離純化后純度怎樣，必須用適當(dāng)試驗(yàn)方法進(jìn)行判定，最常見方法是‘聚丙烯酰胺凝膠電泳’（PolyacrylamideGelElectrophoresisPAGE）,現(xiàn)已發(fā)展成很多方法，如：PAGE圓盤電泳（柱狀電泳）、PAGE垂直板狀電泳等。

酶工程酶制劑制備第28頁CH4-2酶蛋白提純與精制

3酶蛋白純度檢測(cè)⑴電泳基礎(chǔ)原理聚丙烯酰胺凝是由丙烯酰胺單體（Acr)和N，N-亞甲基-雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下，經(jīng)聚合反應(yīng)而形成，依據(jù)欲分離蛋白分子大小，經(jīng)過控制Acr和Bis百分比以及總濃度來控制凝膠孔徑大小，制成各種孔徑凝膠，這么蛋白質(zhì)顆粒在電泳時(shí)，兩種作用力，即電場(chǎng)力和蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)所受阻力，

F=H.Q……………（1）

F/=6π．γην（2）F:電場(chǎng)力；

H：電場(chǎng)強(qiáng)度；Q：質(zhì)點(diǎn)所帶電荷；

F/：：質(zhì)點(diǎn)所受阻力；γ：質(zhì)點(diǎn)半徑；η：電解質(zhì)黏度；ν電泳述度；

酶工程酶制劑制備第29頁在一定電場(chǎng)中，蛋白質(zhì)分子理論電泳遷移述率（即遷移述度）

V=Q/6π．γ.η（3）

從這個(gè)公式中能夠看出，V與蛋白質(zhì)所帶電荷多少成正比，而與蛋白質(zhì)分子大小成反比。不一樣蛋白質(zhì)，其分子量和所帶電荷多少都表現(xiàn)出不一樣程度差異，從而在電泳時(shí)有不一樣遷移輸率，經(jīng)電泳后，不一樣蛋白分子遷移到電泳介質(zhì)不一樣部位，經(jīng)過蛋白質(zhì)染色處理，在凝膠不一樣區(qū)域表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)電泳帶。從這個(gè)原理來講，電泳技術(shù)不但能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純度判定，而且還是分離提純有效方法。酶工程酶制劑制備第30頁電泳技術(shù)分類垂直板電泳毛細(xì)管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤電泳酶工程酶制劑制備第31頁聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

PAGE是在區(qū)帶電泳原理基礎(chǔ)上，以孔徑大小不一樣聚丙烯酰胺凝膠(PAG)作為支持物，采取電泳基質(zhì)不連續(xù)體系(即凝膠層不連續(xù)性、緩沖液離子成份不連續(xù)性、pH不連續(xù)性及電位梯度不連續(xù)性)或連續(xù)體系（一層凝膠、一個(gè)pH和一個(gè)緩沖溶液），進(jìn)行電泳分離一個(gè)方法。

PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N

-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑作用下聚合而成，聚合反應(yīng)催化系統(tǒng)有兩種?；瘜W(xué)聚合:催化劑過硫酸銨(AP)，加速劑TEMED

光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED

不連續(xù)PAGE三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)酶工程酶制劑制備第32頁不連續(xù)PAGE濃縮效應(yīng)

樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質(zhì)ABC++--樣品濃縮膠分離膠電極緩沖液低電位梯度E11高電位梯度E21+-酶工程酶制劑制備第33頁SDS

原理：

當(dāng)SDS（SodiumDodecylSulfate）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了其原來電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間電荷差異就降低乃至消除了。與此同時(shí)蛋白質(zhì)在SDS作用下結(jié)構(gòu)變得渙散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時(shí)產(chǎn)生泳動(dòng)率差異，就反應(yīng)了分子量差異。在此條件下，樣品分子量對(duì)數(shù)與其在凝膠中遷移率呈直線關(guān)系?？捎孟率奖硎荆?/p>

LogMr=a–bmr應(yīng)用:測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)亞基數(shù)Mr（相對(duì)遷移率）mr（相對(duì)遷移率）LogMr酶工程酶制劑制備第34頁等電點(diǎn)聚焦（isoelectricfocusing）原理:

在一定抗對(duì)流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一個(gè)多氨基多羧基混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電經(jīng)過時(shí)，便形成一個(gè)由陽極到陰極pH值逐步上升梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等pH區(qū)域，從而使不一樣化合物能按其各自等電點(diǎn)得到分離。應(yīng)用：

高效率分離純化蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+線性梯度酶工程酶制劑制備第35頁瓊脂糖電泳

瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水L-半乳糖連接組成多糖鏈，這種多糖鏈在1000C左右時(shí)呈液態(tài)，當(dāng)溫度下降到450C以下時(shí)，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性雙鏈單環(huán)瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀瓊脂糖凝膠。

瓊脂糖凝膠用作電泳固相支持物含有分子篩效應(yīng)，其對(duì)生物分子分離作用不但與其分子構(gòu)象及其相對(duì)分子質(zhì)量大小相關(guān)，而且與凝膠濃度也有親密關(guān)系，故可依據(jù)分離對(duì)象分子量大小選擇適當(dāng)濃度凝膠。

瓊脂糖電泳常見于核酸分離，用各種濃度瓊脂糖凝膠能夠分離長(zhǎng)度為2OObP至5OkbDNA，

瓊脂糖凝膠還常見作免疫電泳固相支持物。酶工程酶制劑制備第36頁不一樣濃度瓊脂糖凝膠分離DNA范圍瓊脂糖凝膠濃度／(%)可分辨線性DNA大小范圍／(kb)

0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物水平型平板電泳槽

酶工程酶制劑制備第37頁毛細(xì)管電泳

(CapillaryElectrophoresis，CE)

毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（

2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品分離，分離后樣品依次經(jīng)過設(shè)在毛細(xì)管一端檢測(cè)器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散問題，實(shí)現(xiàn)了快速和高效分離。

毛細(xì)管電泳是多年來發(fā)展起來一項(xiàng)新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響分離伎倆之一。當(dāng)前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成寡核苷酸、DNA序列測(cè)定及PCR產(chǎn)物分析判定等。

毛細(xì)管電泳原理示意圖酶工程酶制劑制備第38頁毛細(xì)管電泳裝置示意圖30KV高壓電源光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集石英玻璃毛細(xì)管緩沖液-樣品緩沖液正極負(fù)極酶工程酶制劑制備第39頁CH4-2酶蛋白提純與精制

3酶蛋白純度檢測(cè)

⑵基礎(chǔ)操作關(guān)鍵點(diǎn)①聚丙烯酰胺凝膠濃度確定凝膠孔徑由丙烯酰胺單體（Acr）和雙體（Bis）總濃度（T%）和雙體占總濃度百分比（C%）所決定。

T%＝（a＋b）/m×100%

C%＝b/（a＋b）×100%a：?jiǎn)误w；b：雙體；m:凝膠溶液體積T％：凝膠總濃度，主要考慮要分離蛋白質(zhì)分子量大小而定；C％決定凝膠交聯(lián)度高低；在T％確定后；調(diào)整C%，可改變凝膠孔徑大小。經(jīng)驗(yàn)公式是：C＝6.5－0.3T

還有些學(xué)者主張固定為C＝5％T

聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表

樣品分子量范圍適宜T%蛋白質(zhì)<10420-30104－4×10415-20

4×104－10510-15105－5×1055-10

>5×1052

-5核酸<10415-20104－1055-10105－2×1062

–2.6②凝膠聚合化學(xué)聚合：用過硫酸銨（AP）作催化劑，用四甲基乙二胺（TEMED）作加速劑；用量：TEMED加總體積0.005倍

PA％加總體積0.05倍聚合時(shí)間普通在室溫下30-60min光聚合：用核黃素作催化劑1mg/100ml③點(diǎn)樣：注意樣品密度和點(diǎn)樣量；④電泳：恒壓電泳和恒流電泳⑤取膠：⑥固定：7%醋酸或12.5％三氯醋酸⑦染色：染色液有氨基黑10B

考馬斯亮蘭G250考馬斯亮蘭R250

⑧蛋白質(zhì)純度確定：純一譜帶酶工程酶制劑制備第40頁三、離心技術(shù)

1．離心機(jī)類別普通離心機(jī)

1000轉(zhuǎn)/分高速離心機(jī)2-3萬轉(zhuǎn)/分超速離心機(jī)

3萬轉(zhuǎn)/分2．沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient,s）3．超離心法類別

密度梯度離心法（densitygradient）

沉降速度法（sedimentationvelocity）

沉降平恒法（sedimentationeguilibrium）酶工程酶制劑制備第41頁離心機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭腔沉降樣品驅(qū)動(dòng)馬達(dá)真空冷凍酶工程酶制劑制備第42頁

沉降系數(shù)

（sedimentationcoefficient）

生物大分子在單位離心力場(chǎng)作用下沉降速度稱為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場(chǎng)作用下，從靜止?fàn)顟B(tài)抵達(dá)極限速度所需要時(shí)間。數(shù)學(xué)定義式為：

沉降系數(shù)單位：因?yàn)榈鞍踪|(zhì)、核酸、病毒等沉降系數(shù)介于1×10-13介于10-13到200×10-13s范圍，為方便起見，把1×10-13s作為沉降系數(shù)一個(gè)單位，用Svedberg單位，用即S表示。沉降系數(shù)（s）與相對(duì)分子量（Mr）關(guān)系:Mr=RTsD(1-

)Svedberg方程:d/dt

2

s=酶工程酶制劑制備第43頁密度梯度離心法（densitygradient）

生物大分子及顆粒沉降不但決定于它大小，而且也取決于它密度。顆粒在含有密度梯度介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大顆粒沉降快，而且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與本身密度相等介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停頓不前，最終各自在離心管中被分離成獨(dú)立區(qū)帶。分成區(qū)帶樣品能夠在管底刺一個(gè)小孔逐滴放出，分步搜集。常見介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品離心管蔗糖密度梯度蔗糖濃度酶工程酶制劑制備第44頁1、核酸密度測(cè)定=o+4.2

2(2-02)10-102、測(cè)定DNA中G-C之含量

Rolfe-Meselson公式：=0.100xG-C+1.6583、溶液中核酸構(gòu)象研究：?jiǎn)捂淒NA雙鏈DNA蛋白質(zhì)雙鏈DNARNA4、核酸制備

氯化銫密度梯度超離心經(jīng)染料-氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒DNA及各種雜質(zhì)分布超螺旋DNA閉環(huán)質(zhì)粒DNA開環(huán)質(zhì)及線型DNA蛋白質(zhì)石蠟油密度梯度沉降平衡法在核酸研究中應(yīng)用酶工程酶制劑制備第45頁沉降速率法（sedimentationvelocity）

在離心場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)分子將沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向（徑向）移動(dòng)，并產(chǎn)生沉降界面，界面移動(dòng)速度代表蛋白質(zhì)沉降速度。在界面處因?yàn)闈舛炔钤斐烧凵渎什灰粯?，可借助適當(dāng)光學(xué)系統(tǒng)，如schlieren光學(xué)系統(tǒng)（也稱暗線光學(xué)攝影系統(tǒng)），觀察到這種界面移動(dòng)。在schlieren光學(xué)系統(tǒng)中，利用溶液折射率梯度（d

/d

）和樣品濃度梯度（dc/d

）成正比這一特點(diǎn)，巧妙地設(shè)計(jì)光路，使移動(dòng)界面以峰形曲線展現(xiàn)在攝影圖片上，峰頂代表移動(dòng)界面。離心機(jī)裝置允許在離心機(jī)轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)時(shí)，對(duì)界面移動(dòng)進(jìn)行觀察和拍照。酶工程酶制劑制備第46頁分析型超速離心機(jī)光源柔性驅(qū)動(dòng)軸熱敏溫度計(jì)樣品池準(zhǔn)直透鏡液面沉降界面溶劑配衡池沉降界面聚光透鏡馬達(dá)濾光片溶質(zhì)空氣沉降方向攝影機(jī)透鏡園柱型透鏡底板Schlieren光閘真空冷凍12c

d

/d

酶工程酶制劑制備第47頁沉降平衡法（sedimentationeguilibrium）

在較低速度（8,000-20,000r/min）離心場(chǎng)中，離心開始時(shí)，分子顆粒發(fā)生沉降，因?yàn)槌两到Y(jié)果造成濃度梯度。因而產(chǎn)生了擴(kuò)散作用，擴(kuò)散力作用方向正與離心力相反，當(dāng)凈離心力與擴(kuò)散平衡時(shí)，在離心池內(nèi)從液面到池低形成一個(gè)由低到高恒定濃度梯度。假如測(cè)得相關(guān)參數(shù)即可算出生物分子分子量。離心力x1軸心液面離心軸擴(kuò)散力x2Mr=(1-)2(

22-

12)2RTdln(c2-c1)計(jì)算公式以下：酶工程酶制劑制備第48頁CH4-3酶制劑成型與保留

1酶制劑主要?jiǎng)┬图捌渲苽洧琶钢苿┲饕獎(jiǎng)┬停?/p>