白紋伊蚊gm與gua株的誘導(dǎo)胞質(zhì)不相容程度評(píng)估

白紋伊蚊gm與gua株的誘導(dǎo)胞質(zhì)不相容程度評(píng)估

近年來，隨著世界的變遷、交通便利、環(huán)境惡化，適應(yīng)蟲生存環(huán)境的地理環(huán)境不斷擴(kuò)張，各種害蟲手段的大規(guī)模爆發(fā)。蚊媒病對(duì)全球的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類正常生活都造成重大影響。然而大多數(shù)病毒性蟲媒病并無特效藥物和有效地疫苗可以應(yīng)用1材料和方法1.1wolbachia為基礎(chǔ)的微生物蚊、gua株、gs株的篩選,其五環(huán)素去除gua的重組株,wp、gm、gs株的建立,其也可以在wolbachia、gm株感染的wp型白紋伊蚊gs、gt株、wp型白紋伊蚊gs、雙環(huán)素蚊、pbp型白紋伊蚊gs、pbp型白紋伊蚊gs、pga、pga、gm株感染gua株、wolbachia等多環(huán)素蚊、pbp型白紋伊蚊、pbp型白紋伊蚊、gs株wp型實(shí)驗(yàn)所涉及的蚊株包括:自然感染wAlbA和wAlbB的廣州本地白紋伊蚊(GUA株)、四環(huán)素去除GUA株Wolbachia感染的白紋伊蚊(GT株)、單感染wPip的白紋伊蚊(GM株)。GM株的建立是將騷擾庫蚊攜帶的wPip型沃爾巴克氏體通過胚胎顯微注射技術(shù)轉(zhuǎn)染至GT株。蚊株均由中山大學(xué)-密歇根州立大學(xué)熱帶病蟲媒控制聯(lián)合研究中心提供。1.2pcr檢測(cè)儀器DNAisoReagent(Takara),動(dòng)勻漿器(Kontes,美國)、電泳儀(DYY-6C,北京)、梯度PCR擴(kuò)增儀(BioMetra,德國)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon,上海)、Milli-Q型純水儀(Millipore,美國)。1.4蚊株的孵化和生殖時(shí)間將三種蚊株的蚊卵各200顆(蚊卵小于7d),分別放置于蚊蟲飼養(yǎng)盒中,加300ml去氯的自來水以浸泡蚊卵,并加0.5mg酵母粉以誘導(dǎo)幼蟲產(chǎn)出。待24h后,將幼蟲計(jì)數(shù)。每天分別于10:00am、16:00pm和22:00pm觀察并計(jì)算成蛹數(shù)目。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蚊蛹轉(zhuǎn)移直徑為2cm、長度為20cm的圓柱塑料管中,每條塑料管所加蚊蛹數(shù)目不大于10個(gè)。塑料管底部浸入水中,頂部加透氣膠塞以防止蚊蛹羽化飛出。同樣每天分別于10:00am、16:00pm和22:00pm記錄羽化成蚊數(shù)目,并判定成蚊性別。記錄蚊蟲的成蛹時(shí)間以及羽化時(shí)間,即一齡幼蟲--蛹和一齡幼蟲--成蚊的時(shí)間。計(jì)算蚊蟲的孵化率、成蛹率、羽化率和雌雄比例,進(jìn)行三種蚊株之間的兩兩比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取3次平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。1.5gm株誘導(dǎo)ci試驗(yàn)GM株能否與自然蚊株交配產(chǎn)生單向或雙向CI現(xiàn)象是其能否應(yīng)用于野外釋放的決定性因素,因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同的雜交組合來評(píng)估GM株的CI程度。將GM、GT以及GUA三種蚊株進(jìn)行不同組合的雜交,觀察不同組合之間的蚊卵孵化率,通過蚊卵孵化率評(píng)價(jià)GM株的CI程度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置四組雜交組合,分別為實(shí)驗(yàn)組:GUA♀×GM♂,GM♀×GUA♂,GT♀×GM♂,GM♀×GT♂;對(duì)照組:GUA♀×GUA♂,GM♀×GM♂,GT♀×GT♂(♀:代表成蚊雌性,♂:代表成蚊雄性)。具體方法為:各取20只剛羽化的雄蚊、雌蚊,置于15cm×15cm×15cm的蚊籠內(nèi),正常飼養(yǎng)。隨機(jī)交配5d后,血餐,2d后放置產(chǎn)卵杯,雌蚊產(chǎn)卵4~5d,計(jì)算產(chǎn)卵量。將所產(chǎn)蚊卵放入裝有清水及酵母粉的孵育盒中,待蚊卵孵化后(至少7d),計(jì)算幼蟲孵化數(shù),七組交配組合蚊卵孵化率進(jìn)行兩兩比較,評(píng)估GM株誘導(dǎo)CI的程度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取3次平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。1.6pcr檢測(cè)蚊株wolbachia類別隨機(jī)抽取三種蚊株雌雄蚊各20只,按照DNAisoReagent(Takara)試劑說明書提取DNA,通過PCR技術(shù)對(duì)三種蚊株的Wolbachia類別進(jìn)行鑒別。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離(150V,20min),引物序列參照文獻(xiàn)見表1。1.7正態(tài)性檢驗(yàn)ls采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布,以(ue0af±s)描述;多重比較方差齊時(shí)采用ANOVA-Bonferroni法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1pcr檢測(cè)蚊株攜帶wolbachia類型及感染率為確定三種蚊株是否真實(shí)攜帶相對(duì)應(yīng)的Wolbachia,因此通過提取實(shí)驗(yàn)蚊株的DNA,PCR檢測(cè)蚊株感染W(wǎng)olbachia類型及相應(yīng)感染率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GUA株攜帶wAlbA、wAlbB兩種類型,感染率100%;GM株單感染wPip,感染率100%;GT株未攜帶任何Wolbachia,見表2。2.2對(duì)蚊蛹、成蚊的存活率蚊卵孵化率、存活率、雄蚊比例、生長周期均進(jìn)行三種蚊株兩兩比較。與GT株和GM株比較,GUA株的蚊卵孵化率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而GM株和GT株差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。蚊蛹、成蚊的存活率,三種蚊株均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。與廣州本地白紋伊蚊GUA株相比較,GM株的蚊蛹發(fā)育周期、成蚊羽化周期均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三種蚊株雌蚊的蚊蛹發(fā)育周期、成蚊羽化周期比雄蚊推遲約24h,見表4。2.3幼苗對(duì)ci的誘導(dǎo)3壓制白紋伊蚊種群數(shù)量的蚊媒防治策略評(píng)價(jià)Wolbachia感染的新型蚊株需從三個(gè)方面進(jìn)行研究盡管wPip感染對(duì)白紋伊蚊的生殖能力(本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表內(nèi)容)和蚊卵孵化率等方面均存在較大消極影響,但GM株與廣州本地白紋伊蚊GUA株交配誘導(dǎo)產(chǎn)生的接近100%的雙向CI和wPip高效率的經(jīng)卵傳遞說明GM株能夠應(yīng)用于基于Wolbachia開展的壓制白紋伊蚊種群數(shù)量的蚊媒防治策略,通過釋放GM株的雄蚊,讓其與野生白紋伊蚊自然交配,能夠使其蚊卵孵化率極低,從而達(dá)到壓制目標(biāo)種群數(shù)量的目的。與傳統(tǒng)的蚊媒防治方法相對(duì)比,該方法能夠?qū)ふ覞摬亟锹淅锏奈孟x,更好的長期抑制蚊媒的種群數(shù)量,后期可通過簡化飼養(yǎng)程序、提高雄性競爭力等方面來消除低生殖能力的負(fù)面影響,使得GM株更加適合蚊媒防治的應(yīng)用。早前研究報(bào)道,與野生蚊株相對(duì)比,異源Wolbachia對(duì)于宿主的影響可能是消極的,也可能是積極的。實(shí)驗(yàn)證明野生白紋伊蚊的生殖能力高于未感染的Wolbachia的白紋伊蚊將蚊卵浸泡于白色塑料盤(40cm×29cm×8cm)中,加過夜的酵母粉懸浮液誘導(dǎo)蚊卵孵化。幼蟲一日齡后,將幼蟲轉(zhuǎn)移至體積為20cm×10cm×5cm的蚊蟲飼養(yǎng)盒,加去氯的自來水,飼養(yǎng)密度維持在120條幼蟲/300ml。幼蟲的飼養(yǎng)食物為可食用酵母粉。成蛹后,將蛹收集至白色塑料杯,放置于體積為30cm×30cm×30cm的蚊籠內(nèi),羽化后喂以10%的葡萄糖水。1.3gm株和gt株相對(duì)比較七組雜交組合的蚊卵孵化率進(jìn)行兩兩比較。在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中,GUA株的蚊卵孵化率與GT株