人工口服感染克氏原螯蝦的消化道組織和血淋巴細胞內分布

人工口服感染克氏原螯蝦的消化道組織和血淋巴細胞內分布

血液抑郁癥（wssv）是線性病毒科（nimavidius）屬于白色斑點病毒。1材料和方法1.1動物分子組織學檢測白斑綜合征病毒浙江株(WSSV-ZJ)系2001年從浙江省寧波地區(qū)典型感染W(wǎng)SSV的中國對蝦(Penaeuschinensis)組織中分離的野生毒株,由浙江大學教育部動物分子營養(yǎng)學重點實驗室鑒定、保存。1.2試驗動物健康活潑、螯肢完整的克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)購自農貿市場,體重(23.0±0.2)g,飼養(yǎng)于水產實驗室。1.3wssv-zj株的感染取試驗螯蝦40尾(實驗前取血淋巴經PCR檢測無WSSV感染),分為感染和對照2個組,每組20尾,飼養(yǎng)于250L玻璃水族箱內,每箱10尾。水溫22～24℃,24h連續(xù)充氣,感染前饑餓48h。將冰凍感染W(wǎng)SSV-ZJ株的中國對蝦頭部組織切成均勻的碎塊,以2%的比例投喂感染組,連續(xù)投喂2天,每天2次,對照組投喂顆粒餌料。觀察螯蝦的臨床癥狀、病程發(fā)展情況及死亡率。1.4組織病理學檢測試驗結束后,解剖取得感染組瀕死蝦和對照組存活蝦的胃、中腸及肝胰腺組織,一部分用Davidson’sAFA液固定,分別用于HE染色光鏡觀察和原位雜交檢測;另一部分上述組織及血淋巴以2.5%戊二醛固定制備電鏡樣品。1.5石蠟包埋石將樣品置于組織脫水機(LeicaTP1020)中進行乙醇系列脫水及二甲苯透明,在組織包埋機(LeicaEG1160)上進行石蠟包埋。用石蠟切片機(LeicaRM2135)進行連續(xù)切片,厚約6μm,用毛筆將切片移至展片機(LeicaHI1210)內展片和沾片,再置于染色機(LeicaAutostainbrXL)內HE染色,中性樹膠封片,在LeicaQwin圖像分析儀上觀察拍照。1.6載玻片的載玻片片制備組織樣品以Davidson’sAFA固定液固定24h后置于70%酒精中,制成5μm的石蠟切片,展片于用500μl/ml多聚賴氨酸預包的載玻片上。組織切片經脫蠟、復水和蛋白酶K溶液(0.1mg/ml)消化,在42℃濕盒中預雜交30min,濕盒內加變性DIG標記WSSV特異性核酸探針(大小547bp,濃度30～50ng/ml,按雷質文等的方法制備1.7電子顯微鏡樣品的制備取胃、中腸及肝胰腺等組織迅速切成1mm2結果2.1發(fā)病蝦及對照存活率不同投喂感染第3天試驗組螯蝦開始死亡,第5～6天出現(xiàn)發(fā)病高峰,第8天死亡率可達100%,而對照組存活率為100%。發(fā)病螯蝦呈現(xiàn)明顯的臨床癥狀:(1)對外界的刺激反應遲鈍,停止攝食,行動遲緩,腹節(jié)卷曲,螯肢無力;(2)瀕死蝦甲殼易與其下的表皮分離,血液顏色微紅,血淋巴稀薄且不易凝固;肝胰腺顏色淡黃,普遍存在空胃現(xiàn)象。2.2感染的分離、鑒定對照組螯蝦的胃、中腸和肝胰腺組織經HE染色,細胞核呈藍色,細胞質呈紅色,細胞形態(tài)清晰,組織結構完整(圖1-1,圖1-3,圖1-5)。病毒感染瀕死螯蝦胃(圖1-2)、中腸(圖1-4)組織的上皮細胞和結締組織細胞呈現(xiàn)典型的病變特征,核腫大多呈球形或短橢圓形,嗜伊紅深染;肝胰腺組織的細胞,核內染色質、核仁消失;細胞膜、細胞形態(tài)模糊不清,結締組織糜爛,只剩少量核及細胞殘屑,壞死上皮及肌束間均有腫大的離散細胞核(圖1-6)。2.3各組螯蝦的雜交行為感染W(wǎng)SSV-ZJ株瀕死螯蝦的胃、中腸和肝胰腺組織的上皮細胞和結締組織細胞均可見明顯的陽性雜交信號(圖2-2,圖2-4,圖2-6),對照組螯蝦的組織細胞均呈陰性雜交反應(圖2-1,圖2-3,圖2-5)。2.4桿狀病毒粒子的檢測在病毒感染的組織超薄切片中,完整病毒粒子的縱切面呈長橢圓形,橫切面為圓形,中間濃染部分是核蛋白構成的髓核,外面包裹一層染色稍淺的蛋白質衣殼,共同組成核衣殼,最外層是脂雙層囊膜,病毒粒子大小約(182～318)nm×90nm,雙層囊膜厚約14nm(圖3-1,圖3-2)。密集的桿狀病毒粒子在細胞核內可形成局部晶格狀排列,但不形成核型多角體或顆粒體類包埋體(圖3-1),并可見一端具有“乳頭狀突起”的病毒粒子和正在裝配囊膜的空衣殼(圖3-2)。宿主細胞的特征性超微病理變化是細胞核腫漲,充滿大量的病毒粒子,染色質邊移乃至消失,核膜難以辯認,細胞質結構逐漸潰散(圖3-3,圖3-4,圖3-10);線粒體大量壞死,嵴斷裂、脫落,內外膜破裂或彼此分離(圖3-5,圖3-7),粗面內質網(wǎng)增生、斷裂、嚴重擴張,或呈指紋樣結構(圖3-6,圖3-8)。對照組螯蝦的細胞結構和形態(tài)完整,未見有桿狀病毒粒子(圖3-9)。3wssv的傳播途徑流行病學調