酚氧化酶原系統(tǒng)在甲殼動物中的應用

酚氧化酶原系統(tǒng)在甲殼動物中的應用

克氏原始繁殖蝦，也被稱為克氏共裂蝦，屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、軟甲殼、足部科。它來自美國，1918年從美國引進日本，1929年從日本引入中國江蘇省南京附近。酚氧化酶是一種含銅的酶,能夠催化單酚羥化成二酚,并把二酚氧化成醌,醌在非酶促條件下形成最終的反應產(chǎn)物黑色素1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗用蝦及其清洗試驗用蝦,雌、雄各10只,體重30~40g,系購于安徽省合肥市杏花菜市場健康蝦。實驗前在水族箱中暫養(yǎng)1周,使其適應水族箱養(yǎng)殖環(huán)境。水族箱在試驗前用1%新潔爾滅浸泡清洗。飼養(yǎng)期間,保持水族箱內(nèi)水溫在20~25℃,pH7.0~7.4,每日晚間按每只蝦0.5g飼喂1次全價顆粒料。1.1.2sybr試劑提取總RNA的試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品,Realtime-PCR采用TaKaRa公司SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)試劑,pGEM-TEasyVector、AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKit、逆轉(zhuǎn)錄酶及其他主要試劑為Promega公司產(chǎn)品。PCR的擴增引物由上海Invitrogen生物有限公司合成。1.1.3高速冷凍離心器熒光定量PCR儀、PCR儀為美國Bio-rad公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機、高速離心機為德國Eppendorf公司產(chǎn)品;其他儀器為購自商業(yè)公司的實驗室常規(guī)儀器。1.2方法1.2.1propof和propor引物的設(shè)計及擴增應用生物學軟件PrimerPrimirer5.0和DNAStar5.01,根據(jù)GenBank上登錄的克氏原螯蝦酚氧化酶原序列(登錄號:EF595973)的保守區(qū)域設(shè)計引物proPOF和proPOR,并用此對引物擴增proPO基因cDNA部分片段(見表1)。引物由上海Invitrogen生物有限公司合成。1.2.2總rna的純化樣品采集:分別無菌采集雌蝦的血淋巴、腸、肝胰腺、肌肉、卵巢、皮膚、腮、胃及雄蝦的血淋巴、腸、肝胰腺、肌肉、精巢、皮膚、腮、胃等組織作為提取總RNA的組織樣品。利用Trizol試劑按如下步驟提取總RNA:用一次性注射器預先抽取適量的抗凝劑,圍心腔抽血約2mL置入5mLEp管,其中全血體積約1mL;4℃,5000r·min其他組織按以下方法處理:取組織約500mg,加5mLTrizol,無菌條件下經(jīng)組織勻漿器充分研磨,取混勻的組織勻漿液1000μL于1.5mLEp管中,劇烈搖動,室溫靜置5min;后續(xù)進程同總RNA提取對應步驟?？俁NA的完整度和純度通過甲醛變性的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。具體方法為:稱取0.5g瓊脂糖粉末,加入放有36.5mLDEPC水的錐形瓶中,加熱使瓊脂糖完全溶解;稍冷卻后加入5mL的10×電泳緩沖液、8.5mL37%的甲醛;然后在膠槽中灌制凝膠,插好梳子,水平放置待凝固后使用;同時在一個潔凈的離心管中混合以下試劑:電泳緩沖液(10×)2μL、37%甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA樣品3.5μL,混勻,置60℃保溫10min,冰上速冷;加入3μL的上樣緩沖液混勻,取適量加樣于凝膠點樣孔內(nèi);穩(wěn)壓7.5V·cm1.2.3pcr法總RNA提取后,經(jīng)檢測合格,即進行cDNA第一鏈的合成,取一滅菌的PCR管,加入RNA3μL,OligodT-anchor1μL,DEPC水8μL,置PCR儀中70℃,5min;立即冰浴;加入5×RTEnzymeBuffer4μL,dNTP(10mmol·L1.2.4pcr擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建以4μL的cDNA作模板,采用引物proPOF和proPOR進行PCR擴增。PCR反應條件為:50μL反應體系中含有10×反應緩沖液5μL、dNTP(10mmol·L將擴增獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物,克隆于pGEM-TEasy載體,轉(zhuǎn)化DH5а大腸桿菌,搖菌提取質(zhì)粒,重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后,交上海Invitrogen生物有限公司測序。1.2.5標準光束成像曲線的制定測定測序鑒定為陽性重組質(zhì)粒的A1.2.6熒光定量pcr法檢測不同組織中酚氧化酶原mrna表達按前述稍加改進的總RNA提取方法,分別提取試驗用健康克氏原螯蝦不同組織,包括腸、肝胰腺、肌肉、卵巢、精巢、皮膚、腮、胃、血淋巴的RNA,按照前述反轉(zhuǎn)錄的方法分別合成cDNA進行實時熒光定量PCR,取不同組織cDNA各2μL,利用上述的PCR反應條件及反應程序,以40個循環(huán)擴增目的基因片段,以檢測克氏原螯蝦不同組織中酚氧化酶原mRNA的表達情況。2結(jié)果與分析2.1醛變性后的瓊脂糖凝膠電泳檢測將從克氏原螯蝦各組織中提取的總RNA用經(jīng)甲醛變性的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果可見清晰的28S、18S2個條帶(見圖1),說明所提RNA可以滿足后續(xù)實驗的要求。2.2反應體系與循環(huán)參數(shù)的驗證利用所抽提的血淋巴組織樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作模板,同時設(shè)陰性對照,按方法1.2.4的反應體系與循環(huán)參數(shù)進行擴增,以驗證所設(shè)計引物的特異性。將所得的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果可見清晰的約300bp的目的條帶,而陰性對照無目的條帶(見圖2),說明設(shè)計合成的引物特異性強,可用于進行熒光定量PCR反應。2.3r-pcr標準曲線的熒光定量2.4克氏原生殖器酚氧化酶原mrna的組織利用Realtime-PCR相對定量方法分析了克氏原螯蝦酚氧化酶原proPOmRNA在不同組織中的表達,采用23克氏原螯蝦propo表達分析本研究通過對克氏原螯蝦酚氧化酶原基因保守序列設(shè)計引物,利用熒光定量PCR方法研究克氏原螯蝦酚氧化酶原基因在不同組織中的表達特征。通過優(yōu)化熒光定量PCR反應條件獲得了檢測proPO的擴增曲線和標準曲線。分別抽提腸、肝胰腺、肌肉、卵巢、精巢、皮膚、腮、胃、血淋巴等組織RNA,利用熒光定量PCR方法對其中proPO的表達進行分析,初步探明了克氏原螯蝦proPO在不同組織中的表達特點?？耸显rproPO的表達具有組織特異性,RealtimePCR的結(jié)果顯示克氏原螯蝦proPOmRNA表達量在血淋巴中最高,其次是肝胰腺、卵巢和精巢,在肌肉、表皮和鰓中有較弱表達,而在腸和胃中幾乎無表達。這與文獻報道的在凡納濱對蝦酚氧化酶原是甲殼動物重要的免疫因子,在清除病原的防御反應中,可能起著重要的作用?？耸显r酚氧化酶原mRNA的表達量在不同病原感染后是否會產(chǎn)生變化以及產(chǎn)生