水稻葉片dna提取方法的建立與應(yīng)用

水稻葉片dna提取方法的建立與應(yīng)用

dna是酶研究的主要對象之一。在植物育種和遺傳繁殖中，重組dna的質(zhì)量是影響其成功的重要因素。人們經(jīng)常需要提取高質(zhì)量的植物DNA,用于構(gòu)建基因文庫、基因組Sourthern分析、酶切、克隆和測序等分子生物學(xué)實驗。根據(jù)植物的研究對象、研究目的和研究成本等不同,提取基因組DNA所應(yīng)用的方法也不同。其中,隨著作物分子輔助育種的廣泛應(yīng)用與推廣,基因型鑒定是最主要的工作,基因組DNA的提取則是最繁重、最耗時的工作之一。目前提取基因組DNA的方法有:1)CTAB提取法。此方法多用于禾本科植物基因組DNA的提取,是1987年Doyle最先應(yīng)用本研究針對以上基因組DNA提取方法存在的不足進行改進,用時大約90s即可完成植物葉片基因組DNA的提取,且完全可以滿足PCR反應(yīng)的基因型鑒定1材料和方法1.1植物材料選取4mg水稻新鮮、幼嫩葉片為試驗材料。1.2pcr擴增試劑盒植物細胞裂解液(裂解液中SDS質(zhì)量百分比濃度為0.06%、EDTA的濃度為25mmol/L、NaCl的濃度為250mmol/L、Tris-base200mmol/L,pH=8.0);DNA漂洗液(Tris-base的濃度為10mmol/L、Tween-20質(zhì)量百分比濃度為0.15%);2×MixturePCR擴增試劑盒購自北京擎天生物科技有限公司;DNAMarkerDL2000,質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DH5α感受態(tài)均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品;Peasy-T載體為北京全式金生物公司產(chǎn)品,其它試劑為分析純;測序工作由北京擎天生物科技有限公司用ABI3730測序儀完成。1.3bah2第三外顯子片段針對水稻Actin基因設(shè)計上下游引物Actin＿FPrimer,Actin＿RPrimer,預(yù)計擴增大小為459bp。針對水稻BADH2第三外顯子片段,擴增片段預(yù)計大小為431bp。Actin＿FPrimer:TGCTATGTACGTCGCCATC-CA,Actin＿RPrimer:AATGAGTAACCACGCTC-CGTC,E3＿FP:GGCATATGCGAGCATTTTAT,E3＿RP:TAGTACCATGCTTGGGTC。以上引物由上海捷瑞生物公司合成,用去離子水將各引物稀釋到10μM工作濃度。1.4植物細胞裂解液的制備植物葉片DNA按以下步驟提取。1)水稻葉片提取材料4mg,裝入圓底EP管中,加1粒直徑4mm的鋼珠,將管子浸入液氮中冷卻,待徹底冷卻后(2～3min),快速用振蕩研磨儀(頻率25次/s,時間30s)將植物組織打碎。2)加入植物細胞裂解液300μL,上下顛倒5～6次,溶液變渾濁,室溫下放置待用,即得到植物材料DNA的粗提液。若無液氮,可先用小剪刀將葉片盡可能剪碎裝入1.5mL尖底EP管中,然后加入500μL植物細胞裂解液振蕩破碎組織。3)將干凈脫脂棉簽浸入步驟二中的DNA的粗提液3s,將浸潤的棉簽迅速在DNA漂洗液中輕輕漂洗3次,然后再將其在100μL去離子水(ddH1.5pcr擴增范圍為了驗證所提DNA是否滿足PCR擴增,選取水稻肌動蛋白基因Actin設(shè)計的上述引物,預(yù)計擴增大小為459bp。按照以下PCR反應(yīng)體系配置反應(yīng)液20μL:2×Mixture,10μL;Actin-FPrimer,1μL;Actin-BPrimer,1μL:上述DNA溶液2μL;ddH1.6梯度稀釋“梯度”稀釋為了檢測其靈敏度,對所提DNA溶液進行了梯度稀釋。首先吸取2μLDNA溶液至8μL去離子水中,再從稀釋溶液中吸取2～8μL去離子水,依次稀釋到101.7雙向基因pcr檢測水稻osbadh2基因片段的擴增為了檢測此方法所提DNA是否滿足克隆、測序的需要,用E3＿FP,E3＿RP引物對水稻OsBADH2基因的片段進行擴增,預(yù)計擴增大小為431bp,用膠回收試劑盒將其回收,然后連接Peasy-T載體,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌,挑取陽性克隆進行測序分析。膠回收步驟、連接體系、轉(zhuǎn)化方法和質(zhì)粒提取均按試劑盒說明書進行。2結(jié)果與分析2.1dna提取方法依據(jù)以上的提取方法,得到DNA粗提液效果見圖1。圓底EP管中,溶液呈翠綠色,植物組勻漿徹底,表明使用液氮效果較好。所得DNA溶液為Ⅰ。無液氮提取效果見圖2。此方法得到的DNA粗提溶液較前法較淡,一些葉片組織明顯未被破碎。但通過延長破碎時間改善組織破碎效果。所得到DNA溶液為Ⅱ。2.2actin基因凝膠電泳液氮研磨法和無液氮研磨法2種提取方法,分別用水稻Actin基因的上述引物進行了PCR,其產(chǎn)物的凝膠電泳分別見圖3和圖4。兩圖中均有459bp條帶擴增,說明2種方法所提DNA溶液滿足基因擴增的需要。2.3tin基因pcr擴增以液氮方法提取的DNA溶液梯度稀釋后作為模板,以水稻Actin基因設(shè)計的引物進行擴增,PCR產(chǎn)物凝膠電泳見圖5,從左到右稀釋倍數(shù)依次遞增。圖中結(jié)果表明,此方法提取的DNA溶液1000萬倍稀釋,依然可以進行目的基因的PCR擴增。2.4陽性克隆質(zhì)粒的鑒定以E3＿FP,E3＿RP引物對水稻OsBADH2基因的片段擴增結(jié)果見圖6,擴增片段大小為431bp;陽性克隆質(zhì)粒的測序結(jié)果見圖7。測序峰圖清晰,經(jīng)比對完全與參考序列一致,此方法所提DNA完全滿足基因克隆、測序的需要。3dna提取方法的應(yīng)用本研究以水稻幼苗葉片為試驗材料,