人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)iPSC的實(shí)驗(yàn)研究

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目

申請(qǐng)書(shū)項(xiàng)目名稱(chēng)：人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究-項(xiàng)目領(lǐng)域：□農(nóng)業(yè)□工業(yè)□社會(huì)發(fā)展

申請(qǐng)單位（簽章）：河南省人民醫(yī)院協(xié)作單位：推薦部門(mén)（簽章）：河南省衛(wèi)生廳填報(bào)日期:2009年8月28日河南省科學(xué)技術(shù)廳制填報(bào)說(shuō)明1．根據(jù)《河南省科技攻關(guān)計(jì)劃管理辦法》規(guī)定，申報(bào)省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目必須填報(bào)《河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目申請(qǐng)書(shū)》。2．“項(xiàng)目申請(qǐng)書(shū)”經(jīng)省直主管部門(mén)、省轄市（擴(kuò)權(quán)縣、市）科技主管部門(mén)、國(guó)家級(jí)或省級(jí)高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)管委會(huì)簽署意見(jiàn)并蓋章后一式五份報(bào)送。3．“項(xiàng)目申請(qǐng)書(shū)”的內(nèi)容必須真實(shí)、所附材料齊全，要求項(xiàng)目研究、開(kāi)發(fā)目標(biāo)明確，內(nèi)容重點(diǎn)突出，技術(shù)路線清晰，主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)科學(xué)、合理，階段目標(biāo)和年度進(jìn)展計(jì)劃明確，經(jīng)費(fèi)預(yù)算合理。4．若項(xiàng)目申報(bào)者有協(xié)作單位，請(qǐng)?zhí)顓f(xié)作單位概況，且必須在“項(xiàng)目申請(qǐng)書(shū)”后附合作協(xié)議（合同）。5．“項(xiàng)目申請(qǐng)書(shū)”中引用的名稱(chēng)、數(shù)據(jù)等內(nèi)容均應(yīng)標(biāo)明出處，外文縮寫(xiě)應(yīng)注明全稱(chēng)。6．“項(xiàng)目申請(qǐng)書(shū)”中未列但需說(shuō)明的內(nèi)容可加附頁(yè)，相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)、證明文件等材料應(yīng)作為附件一同上報(bào)，規(guī)格統(tǒng)一使用A4紙，打印文字采用4號(hào)宋體字。項(xiàng)目概況項(xiàng)目名稱(chēng)人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究預(yù)期主要成果形式1、論文論著2、研究報(bào)告3、新產(chǎn)品或農(nóng)業(yè)新品種4、新□□□設(shè)備5、新材料6、新工藝或方法7、軟件9、其他經(jīng)費(fèi)合計(jì)（萬(wàn)元）申請(qǐng)撥款匹配銀行貸款自籌其他20150050申請(qǐng)單位概況單位名稱(chēng)河南省人民醫(yī)院?jiǎn)挝恍再|(zhì)□1、企業(yè)2、科研院所3、高等學(xué)校9、其他企業(yè)登記注冊(cè)類(lèi)型□1、國(guó)有企業(yè)2、集體企業(yè)3、股份合作企業(yè)4、聯(lián)營(yíng)企業(yè)5、有限公司6、股份有限公司7、私營(yíng)企業(yè)8、港澳臺(tái)投資企k9、外商投資企業(yè)地址鄭州市緯五路7號(hào)所在省級(jí)產(chǎn)業(yè)集聚區(qū)聯(lián)系人趙志剛電話65580059傳真65674278郵編450003職工總數(shù)2300技術(shù)人員1850中咼級(jí)技術(shù)人員1650主要參加人員姓名性別出生年月學(xué)歷從事專(zhuān)業(yè)職稱(chēng)（職務(wù)）魏曉霞女1965.10本科生化檢驗(yàn)副主任技師梁玉女1971.11本科輸血主管技師陳鳳英女1957.08大專(zhuān)臨床檢驗(yàn)主管技師協(xié)作單位概況單位名稱(chēng)附合作協(xié)議（合同）單位性質(zhì)□1、企業(yè)2、科研院所3、高等學(xué)校9、其他企業(yè)登記注冊(cè)類(lèi)型□1、國(guó)有企業(yè)2、集體企業(yè)3、股份合作企業(yè)4、聯(lián)營(yíng)企業(yè)5、有限公司6、股份有限公司7、私營(yíng)企業(yè)8、港澳臺(tái)投資企k9、外商投資企業(yè)地址所在省級(jí)產(chǎn)業(yè)集聚區(qū)聯(lián)系人電話傳真郵編職工總數(shù)技術(shù)人員中咼級(jí)技術(shù)人員主要參加人員姓名性別出生年月學(xué)歷從事專(zhuān)業(yè)職稱(chēng)（職務(wù)）項(xiàng)目主要研究、開(kāi)發(fā)內(nèi)容(不超過(guò)100個(gè)漢字)利用人皮膚成纖維細(xì)胞通過(guò)導(dǎo)入干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2和Nanog基因，誘導(dǎo)生成多能干細(xì)胞(inducedPluripotentStemCell,iPSC),可以分化成自身所需的組織或器官，用于組織損傷修復(fù)及疾病治療，避免異源移植排斥。申請(qǐng)項(xiàng)目的依據(jù)和意義(說(shuō)明國(guó)家產(chǎn)業(yè)技術(shù)政策，國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展水平和趨勢(shì))申請(qǐng)項(xiàng)目的依據(jù)：2006年，日本京都大學(xué)ShinyaYamanaka將四種基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4轉(zhuǎn)入已完全分化的小鼠纖維母細(xì)胞，得到了能轉(zhuǎn)換為各種體細(xì)胞的類(lèi)胚胎干細(xì)胞，后稱(chēng)之為iPSC(Cell2006,126:663-76)，將iPSC移植到小鼠皮下組織，可發(fā)育為畸胎瘤(teratomas)(胚胎干細(xì)胞的一個(gè)重要性質(zhì))。2007年在此基礎(chǔ)上又增加了連接有一段抗藥性基因的Nanog,得到了第二代iPSC，能和成鼠形成嵌合體并產(chǎn)生后代(Nature2007,448:313-7)。后來(lái)美國(guó)RudolfJaenisch實(shí)驗(yàn)室也利用這四種相同的轉(zhuǎn)錄因子成果的誘導(dǎo)出iPSC(NatBiotechnol,2007,25:1177-81)。同年，ShinyaYamanaka又成果的將人類(lèi)皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變成iPSC(NatProtoc,2007,2:3081-9；Cell,2007,131:861-72),同時(shí)美國(guó)JamesThomson實(shí)驗(yàn)室也可以將人類(lèi)體細(xì)胞重新設(shè)定變回干細(xì)胞(Science,2007,318:1917-20)。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果被Nature和Science列為2007年十大重要發(fā)現(xiàn)之一，全世界頂尖的干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室都投入到iPS的研究中，以期能早日把這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用到人身上。2008年，美國(guó)波士頓的GeorgeQ.Daley實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)能利用ShinyaYamanaka建立的技術(shù)，將取自胎兒的肺、皮膚細(xì)胞、新生兒的皮膚細(xì)胞及健康人的皮膚樣本，轉(zhuǎn)化成為iPS細(xì)胞，量身訂做一個(gè)私人的干細(xì)胞庫(kù)?，F(xiàn)在研究證明，不僅在胚胎，在人體所有組織器官中都有干細(xì)胞存在；人體內(nèi)所有干細(xì)胞都可分化成各種功能的成熟的體細(xì)胞；而所有人體成熟體細(xì)胞也都可轉(zhuǎn)化重編成干細(xì)胞；在實(shí)驗(yàn)中干細(xì)胞對(duì)人體幾乎所有損傷的組織和器官都具有修復(fù)和治療作用，為我們揭示了干細(xì)胞研究和應(yīng)用的激動(dòng)人心的發(fā)展前景。鑒于干細(xì)胞的重大應(yīng)用前景，國(guó)家制訂了《國(guó)家中長(zhǎng)期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)》，科技部已先后批準(zhǔn)了14個(gè)干細(xì)胞研究重大項(xiàng)目，安排經(jīng)費(fèi)3.5億元。其中三個(gè)項(xiàng)目(中科院動(dòng)物所周琪，上交大醫(yī)學(xué)院曾凡一)已經(jīng)制備了37株iPS細(xì)胞，獲得27個(gè)活體小鼠，經(jīng)多種分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，證實(shí)這些小鼠確實(shí)系iPS細(xì)胞發(fā)育而成，這是世界上第一次獲得完全由iPS細(xì)胞制備的活體小鼠，有力的證明了iPSC具有真正的全能性。國(guó)內(nèi)目前就人源體細(xì)胞轉(zhuǎn)化iPSC的研究也在進(jìn)行中，去年國(guó)家自然科學(xué)基金核批了資助了226項(xiàng)干細(xì)胞項(xiàng)目。項(xiàng)目研究開(kāi)發(fā)內(nèi)容及目標(biāo)(實(shí)施方案、技術(shù)關(guān)鍵、技術(shù)路線和技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)等)項(xiàng)目實(shí)施方案：通過(guò)慢病毒介導(dǎo)將源自人臍血干細(xì)胞的Oct4、Sox2和Nanog基因?qū)朐醋匀似つw組織的成纖維母細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)上述基因的細(xì)胞株，通過(guò)指紋圖譜(fingerprinting)、染色體組型分析(karyotypeanalysis)、畸胎瘤形成及向各胚層分化能力鑒定，誘導(dǎo)出多能干細(xì)胞(iPSC)。項(xiàng)目技術(shù)關(guān)鍵：慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率：慢病毒載體的構(gòu)建是本課題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用GFP報(bào)道基因便于檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；慢病毒帶來(lái)的潛在生物安全問(wèn)題：本課題采用第三代自我失活型慢病毒載體導(dǎo)入目的基因，是目前安全性最高的基因?qū)敕椒ǎ覍?duì)分裂和不分裂的細(xì)胞都有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。該載體只含有HIV-1共9個(gè)基因中的3個(gè)，即gag、pol、rev，由于HIV-1基因組成分中60%被去除，因此父代病毒無(wú)法復(fù)制，載體本身只是將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞內(nèi)的工具。利用逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制構(gòu)建自我失活(SIV)的HIV-1來(lái)源的載體，一旦轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞后，它就喪失了病毒長(zhǎng)末端重復(fù)的轉(zhuǎn)錄能力，減少了產(chǎn)生重組病毒的機(jī)會(huì)，并避免了與啟動(dòng)子干擾的問(wèn)題。以HIV-1為基礎(chǔ)的第3代慢病毒載體系統(tǒng)的安全性甚至超過(guò)了目前臨床試驗(yàn)正在使用的致癌性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。同時(shí)在導(dǎo)入后可以進(jìn)行相關(guān)的基因檢測(cè)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以確保病毒失活，使用安全。項(xiàng)目技術(shù)路線：實(shí)施本項(xiàng)目已具備的條件（說(shuō)明已具備的試驗(yàn)手段、技術(shù)力量、管理水平、前期科研基礎(chǔ)、中試后接產(chǎn)單位及專(zhuān)利獲得等情況）1,堅(jiān)實(shí)的前期基礎(chǔ)：本研究是不斷跟蹤近幾年干細(xì)胞領(lǐng)域的大量研究成果，特別是誘導(dǎo)干細(xì)胞相繼在日本和美國(guó)培育成功的基礎(chǔ)上，提出的從人成纖維細(xì)胞利用臍血干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)培育iPSC的探索。臍血來(lái)源充足，免疫磁珠分選操作簡(jiǎn)便。我們已經(jīng)成功的從臍血中分離出hSC，可以從中提取出Nanog,Oct4及Sox2基因。參與正在進(jìn)行中的省攻關(guān)課題“雙特異性抗體打靶表達(dá)CD133和EGFRvIII的腫瘤干細(xì)胞”是采用基因重組抗體工程技術(shù)，已經(jīng)順利構(gòu)建成功了能克隆多個(gè)基因片段的雙特異性抗體表達(dá)載體，摸索出一套適合本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)方法，為本課題的順利進(jìn)行積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)和堅(jiān)實(shí)的工作基礎(chǔ)。2，所用實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟：本實(shí)驗(yàn)采取的實(shí)驗(yàn)方法（如免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR、SouthernBlot、WesternBlot、免疫磁珠分選、熒光定量PCR等）均為國(guó)內(nèi)外應(yīng)用多年的經(jīng)典方法或近幾年新興的較先進(jìn)方法，慢病毒載體的構(gòu)建現(xiàn)已商品化，比較成熟；本項(xiàng)目組由掌握以上方法的成員組成，都有多年科研工作經(jīng)驗(yàn)。3，實(shí)驗(yàn)設(shè)備完善：我院新成立的中心實(shí)驗(yàn)室設(shè)施一流，擁有三個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室，一個(gè)GMP實(shí)驗(yàn)室，三個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，有SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)條件，全天24小時(shí)開(kāi)放使用，科研儀器齊全，如流式細(xì)胞儀、磁珠分選儀、熒光定量PCR、測(cè)序儀、-80及-160度冰柜、熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，以及co2培養(yǎng)箱、雜交爐、（倒置）顯微鏡、低溫超速離心機(jī)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等，均配備有專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員提供支持和保養(yǎng)維護(hù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制具有重要的保證作用。4,規(guī)范化科學(xué)管理：我院領(lǐng)導(dǎo)重視科研，倡導(dǎo)“科教興院”對(duì)科研項(xiàng)目大力支持，規(guī)范管理，設(shè)有專(zhuān)職部門(mén)指導(dǎo)科研立項(xiàng)，檢查監(jiān)督科研的執(zhí)行，對(duì)按質(zhì)按期完成課題具有重要的促進(jìn)作用。5，技術(shù)力量雄厚：我院的干細(xì)胞研究中心擁有許多長(zhǎng)年從事干細(xì)胞基礎(chǔ)和臨床研究工作的專(zhuān)家教授，能給本課題提供強(qiáng)有力的指導(dǎo)與支持，本院同時(shí)還擁有生物治療研究中心，血研所造血干細(xì)胞移植中心，血液研究所，生殖醫(yī)學(xué)研究中心胚胎培養(yǎng)室，眼科研究所組織工程學(xué)研究室，遺傳研究所遺傳研究室等重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室可為本項(xiàng)目的工作提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)和技術(shù)保障。項(xiàng)目實(shí)施的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境預(yù)期效益本項(xiàng)目社會(huì)效益重大：iPSC為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，是當(dāng)今生命科學(xué)的前沿?zé)狳c(diǎn)，在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為實(shí)施再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療的重要細(xì)胞來(lái)源。它不僅對(duì)人類(lèi)生殖發(fā)育、細(xì)胞分化、器官生成而且對(duì)人類(lèi)疾病的發(fā)生、損傷修復(fù)、組織器官的再生和疾病防治都具有及其深遠(yuǎn)的理論和實(shí)際意義。目前干細(xì)胞應(yīng)用于臨床的治療已有近萬(wàn)例報(bào)告，取得很多可喜的成果，如人工氣管、白血病、脊髓損傷、糖尿病、心力衰竭等,未來(lái)的研究及開(kāi)發(fā)領(lǐng)域包括表皮干細(xì)胞抗老化，利用干細(xì)胞重建乳房，靶向腫瘤干細(xì)胞，研發(fā)抗癌新藥，利用干細(xì)胞培育出神經(jīng)細(xì)胞及肝組織等，對(duì)許多重大疾病的治療均可發(fā)揮巨大作用。經(jīng)濟(jì)效益顯著：干細(xì)胞的潛在市場(chǎng)龐大，2001年全球干細(xì)胞應(yīng)用市場(chǎng)約有3.3億美元，2004年已有10億美元，2007年時(shí)逼近20億美元，平均每年以34%的成長(zhǎng)率增長(zhǎng)。面對(duì)如此重大社會(huì)效益和龐大的市場(chǎng)，國(guó)家和地方政府都對(duì)干細(xì)胞研究給予大力支持，如科技部973、863計(jì)劃，國(guó)家自然科學(xué)基金，國(guó)家發(fā)改委產(chǎn)業(yè)化計(jì)劃等，大大促進(jìn)了我國(guó)在干細(xì)胞領(lǐng)域的發(fā)展，縮短了與國(guó)際先進(jìn)水平的差距，有些方面還領(lǐng)先于國(guó)外，為我國(guó)在生物世紀(jì)搶占市場(chǎng)份額，充分挖掘經(jīng)濟(jì)效益提供有利條件。預(yù)期目的明確：建立幾株源自人的iPS細(xì)胞，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其臨床應(yīng)用價(jià)值提供物質(zhì)條件；同時(shí)開(kāi)發(fā)一套轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入培育誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)，為最終應(yīng)用于疾病治療奠定基礎(chǔ)。項(xiàng)目實(shí)施的計(jì)劃進(jìn)度2010.01-2010.07采集臍血，免疫磁珠分選純化CD34剖胞，流式細(xì)胞儀鑒定純度，在培養(yǎng)過(guò)程中，鑒定表型，優(yōu)化增殖條件；2010.08-2011.06設(shè)計(jì)引物，從臍