病毒感染的診斷與防治課件

第三章病毒感染的診斷與防治吉林大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室1感謝你的觀看2019年8月29第三章病毒感染的診斷與防治吉林大學基礎醫(yī)學院1感謝你的觀常用的病毒學診斷方法包括：病毒的分離鑒定病毒的血清學檢查病毒蛋白和核酸的檢測第一節(jié)病毒感染的診斷2感謝你的觀看2019年8月29常用的病毒學診斷方法包括：第一節(jié)病毒感染的診斷2感謝你的一、標本的采取與送檢應注意下列原則：1.對本身帶有雜菌(如咽拭子、糞便)或易受污染的標本，要進行病毒分離培養(yǎng)時，應使用抗生素。2.因病毒在室溫中易失去活性，標本應低溫保存并盡快送檢。3.血清學診斷標本的采取應在發(fā)病初期和病后2～3w內(nèi)各取1份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態(tài)變化。3感謝你的觀看2019年8月29一、標本的采取與送檢應注意下列原則：3感謝你的觀看2019年二、病毒的分離與鑒定(一)病毒的分離1.動物接種是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。

4感謝你的觀看2019年8月29二、病毒的分離與鑒定(一)病毒的分離4感謝你的觀看2012.雞胚培養(yǎng)雞胚對多種病毒敏感。一般采用孵化9～14天的雞胚，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。5感謝你的觀看2019年8月292.雞胚培養(yǎng)5感謝你的觀看2019年8月296感謝你的觀看2019年8月296感謝你的觀看2019年8月297感謝你的觀看2019年8月297感謝你的觀看2019年8月293.組織培養(yǎng)法(tissueculture)或細胞培養(yǎng)(cellculture)法是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。8感謝你的觀看2019年8月293.組織培養(yǎng)法(tissueculture)或細胞培養(yǎng)9感謝你的觀看2019年8月299感謝你的觀看2019年8月29

細胞的變化有些病毒在細胞內(nèi)增殖時可引起特有的細胞病變，稱為細胞病變效應(CPE)。常見的變化有細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等作用于細胞膜，可使鄰近的細胞相互融合，形成多核巨細胞或稱融合細胞。有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培養(yǎng)細胞中形成胞漿或核內(nèi)的包涵體。病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的指標10感謝你的觀看2019年8月29細胞的變化病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的指標10感謝你的觀看20111感謝你的觀看2019年8月2911感謝你的觀看2019年8月29病毒培養(yǎng)時出現(xiàn)的CPE12感謝你的觀看2019年8月29病毒培養(yǎng)時出現(xiàn)的CPE12感謝你的觀看2019年8月292.紅細胞吸附(hemadsorption,HAd)流感或副流感病毒等感染細胞后，由于細胞膜上出現(xiàn)了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎動物(豚鼠、雞、猴等)紅細胞的能力，這一現(xiàn)象稱紅細胞吸附，常用來測定具有HA的粘病毒與副粘病毒的增殖。若有相應的抗血清，則能中和細胞膜上的HA，HAd不再發(fā)生，稱紅細胞吸附抑制試驗。13感謝你的觀看2019年8月292.紅細胞吸附(hemadsorption,HAd)13感3.干擾現(xiàn)象(interference)某些病毒感染細胞時不出現(xiàn)CPE或其他易于測出的變化(如HAd)，但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖。如風疹病毒感染Vero細胞時CPE不明顯，但它能干擾后感染的?？刹《?ECHOV)的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE。14感謝你的觀看2019年8月293.干擾現(xiàn)象(interference)14感謝你的觀看204.細胞代謝的改變病毒感染細胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH值改變，說明細胞的代謝在病毒感染后發(fā)生了變化。這種培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖的指標。15感謝你的觀看2019年8月294.細胞代謝的改變15感謝你的觀看2019年8月29(二)病毒的數(shù)量與感染性測定

1.蝕斑測定是一種檢查和準確滴定病毒感染性的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細胞培養(yǎng)中有限擴散。結(jié)果是每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產(chǎn)生一個局限性的感染灶。用活性染料(如中性紅)染色，則活細胞著色，受病毒感染而破壞的細胞不著色，形成肉眼可見的蝕斑(plaque)。每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作蝕斑形成單位(plaqueformingunit,PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。16感謝你的觀看2019年8月29(二)病毒的數(shù)量與感染性測定1.蝕斑測定16感謝你的觀看2.50%組織細胞感染量(TCID50)測定法該方法是測定病毒能使50%的組織培養(yǎng)細胞發(fā)生感染的最小量。一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋，分別接種細胞，經(jīng)一定時間后觀察CPE、血細胞吸附等指標，以最高稀釋度能感染50%細胞的量為終點。最后用統(tǒng)計方法計算出50%組織細胞感染量（50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50)。17感謝你的觀看2019年8月292.50%組織細胞感染量(TCID50)測定法17感謝三、病毒感染的血清學診斷原理是用已知病毒抗原來檢測病人血清中有無相應抗體，故須待病人感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時才能檢出。另外，在采取臨床標本及病人血清應注意病程，必須采取患者急性期血清與恢復期血清(雙份血清)進行血清學試驗。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時，才有診斷意義。18感謝你的觀看2019年8月29三、病毒感染的血清學診斷原理是用已知病毒抗1.中和試驗(neutralizingtest,NTtest)

是病毒在活體內(nèi)或細胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗。中和抗體(netralizingantibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原(衣殼或包膜)的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，特異性高，而且抗體在體內(nèi)維持時間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。因此，中和試驗適用于人群免疫情況的調(diào)查，在臨床診斷上較少使用。19感謝你的觀看2019年8月291.中和試驗(neutralizingtest,NTte2.補體結(jié)合試驗

(complementfixationtest,CFtest)用已知病毒可溶性(CF)抗原來檢測病人血清中相應(CF)抗體。CF抗原是病毒的內(nèi)部抗原，同種異型間常有交叉，故特異性較中和試驗低。但CF抗體出現(xiàn)較早，消失較快，故CF陽性可作為近期感染的指標。20感謝你的觀看2019年8月292.補體結(jié)合試驗(complementfixation3.血凝抑制試驗(hemagglutinatiainhibitiontest,HItest)

具有HA的病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，稱血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被相應抗體抑制，稱HI試驗。其原理是相應抗體與病毒結(jié)合后，阻抑了病毒表面的HA與紅細胞的結(jié)合。本試驗簡易、經(jīng)濟，特異性高，常用于粘病毒及乙型腦炎病毒感染的輔助診斷及流行病學調(diào)查，也可鑒定病毒的型與亞型。21感謝你的觀看2019年8月293.血凝抑制試驗(hemagglutinatiainhib病毒+雞RBC=凝集（血凝試驗）病毒+特異性抗體+雞RBC=不凝集（血凝抑制試驗）22感謝你的觀看2019年8月2922感謝你的觀看2019年8月29四、病毒感染的快速診斷

快速診斷主要是指從含有病毒標本及感染機體的血清中檢測病毒顆粒、蛋白抗原、IgM抗體和核酸等，往往在數(shù)小時內(nèi)即可得出結(jié)果。23感謝你的觀看2019年8月29四、病毒感染的快速診斷快速診斷主要是指從含有病毒標本及(一)形態(tài)學檢查1.電鏡和免疫電鏡檢查2.普通光學顯微鏡檢查有些病毒在宿主細胞內(nèi)增殖后，在細胞的一定部位(胞核、胞漿或兩者兼有)出現(xiàn)一個或數(shù)個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜堿性的結(jié)構(gòu)，即包涵體。包涵體對病毒感染的診斷有一定價值。24感謝你的觀看2019年8月29(一)形態(tài)學檢查1.電鏡和免疫電鏡檢查24感謝你的觀看2(二)病毒蛋白抗原檢查

用熒光素、放射性同位素、過氧化物酶等標記抗體，采用免疫學和分子生物學技術(shù)，檢測標本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、特異、快速等優(yōu)點。1.免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence,IF)2.固相放射免疫測定(solid-phaseradioimmunoassay,SPRIA)3.酶免疫技術(shù)(enzymeimmunoassay,EIA)此法可檢測多種病毒及其抗體，主要是酶免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)。25感謝你的觀看2019年8月29(二)病毒蛋白抗原檢查用熒光素、放射性同位素、過氧化(三)特異性IgM抗體的檢測

檢測病毒特異性IgM抗體可診斷急性感染，特別是對證實孕婦感染風疹病毒尤為重要，但應注意類風濕因子(IgM)的干擾。另外，檢測早期抗原的抗體是快速診斷的另一途徑。如檢測針對EBV的早期抗原(EA)、核心抗原(EANA)和衣殼抗原(VCA)等的抗體，可以區(qū)別急性或慢性EBV感染。此外，分子生物學檢測技術(shù)、氣相色譜技術(shù)等，均可用來分析和鑒定病毒感染。26感謝你的觀看2019年8月29(三)特異性IgM抗體的檢測檢測病毒特異性IgM抗體(四)檢測病毒核酸

1.核酸雜交技術(shù)用于病毒檢測的有斑點雜交、細胞內(nèi)原位雜交、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。2.核酸擴增法目前多數(shù)病毒基因已通過分子克隆技術(shù)被明確了核苷酸序列，使得DNA擴增技術(shù)逐步發(fā)展為常規(guī)診斷技術(shù)之一。3.基因芯片技術(shù)27感謝你的觀看2019年8月29(四)檢測病毒核酸1.核酸雜交技術(shù)用于病毒檢測的有斑點基因芯片又稱DNA芯片、生物芯片（biochip）。其原理是：將已知的生物分子探針或基因探針，大規(guī)?；蛴行蚺挪加谛K硅片等載體上，與待測樣品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反應，在激光的激發(fā)下，產(chǎn)生的熒光譜信號被接受器收集，計算機自動分析處理數(shù)據(jù)并報告結(jié)果。其優(yōu)點是：可以一次性完成大量樣品DNA序列的檢測和分析，解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)的許多不足。芯片技術(shù)在病毒等微生物學診斷和流行病學調(diào)查方面有著廣闊的應用前景。28感謝你的觀看2019年8月29基因芯片又稱DNA芯片、生物芯片（biochip）。2第二節(jié)病毒感染的預防一、人工自動免疫(一)活疫苗(attenuatedvaccine,orlivingvaccine)1.常規(guī)活疫苗即減毒活疫苗(attenuatedvaccine)，通常是用自然或人工選擇法(如溫度敏感株)篩選的對人低毒或無毒的變異株制成的疫苗，如脊髓灰質(zhì)炎、流感、麻疹的減毒活疫苗等。29感謝你的觀看2019年8月29第二節(jié)病毒感染的預防一、人工自動免疫29感謝你的觀看2012.新型活疫苗應用基因工程技術(shù)，控制病毒變異，或利用DNA重組技術(shù)，插入和定向缺失病毒基因，將保護性病毒蛋白的編碼基因插入活載體中或選擇性地去除病毒的某一個或幾個致病基因而達到減毒作用制備的可在機體內(nèi)增殖，誘發(fā)抗病毒免疫應答的疫苗。30感謝你的觀看2019年8月292.新型活疫苗應用基因工程技術(shù)，控制病毒變異，或利用DN(二)死疫苗(killedvaccine)1.滅活全病毒疫苗應用物理或化學方法使病毒完全滅活而制成的疫苗。常用的有乙型腦炎、狂犬病、流感等滅活疫苗。2.亞單位疫苗(subunitvaccine)制備不含有病毒核酸、僅含有能誘發(fā)中和抗體的病毒衣殼蛋白或包膜表面抗原，是最理想的疫苗。3.合成肽病毒疫苗(synthesizedpeptideviralvaccine)人工合成與病毒保護性抗原決定簇的氨基酸序列相同的肽段，制備成免疫原后免疫動物或人體，使機體產(chǎn)生保護性抗體31感謝你的觀看2019年8月29(二)死疫苗(killedvaccine)1.滅活全病毒疫4.基因工程疫苗(geneengineringvaccine)利用基因工程技術(shù)，分離、重組、轉(zhuǎn)化和表達基因，制備出的能引起人體保護性免疫應答疫苗。5.DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，這種核酸分子是一種細菌的質(zhì)粒，在克隆了特異性的基因以后，能在真核細胞中表達蛋白質(zhì)抗原，刺激機體產(chǎn)生特異性體液和細胞免疫。6.新型多價聯(lián)合疫苗、口服疫苗的研究32感謝你的觀看2019年8月294.基因工程疫苗(geneengineringvaccin減毒活疫苗與死疫苗優(yōu)缺點比較特點減毒活疫苗死疫苗制備方法通過非正常培養(yǎng)減毒株通過化學物理方法使感染失活免疫接種一般為一次性多次免疫疫苗的穩(wěn)定性相對不穩(wěn)定相對穩(wěn)定免疫的類型體液免疫和細胞免疫體液免疫毒力回升有可能不可能安全性對免疫缺陷者有危險安全性好生產(chǎn)和成本生產(chǎn)較復雜、成本高生產(chǎn)簡單、成本低33感謝你的觀看2019年8月29減毒活疫苗與死疫苗優(yōu)缺點比較特點減毒活疫苗死疫苗制備方法通過二、人工被動免疫人工被動免疫的制劑有免疫血清和丙種球蛋白，或與細胞免疫有關(guān)的因子等。大多數(shù)人均受過不同種類的病毒感染，從正常血清中提取免疫球蛋白可用于緊急預防。常注射人免疫球蛋白預防甲型肝炎、麻疹、脊髓灰質(zhì)炎等。可使接觸病原者不出現(xiàn)癥狀或僅出現(xiàn)輕微癥狀。近年來有人應用含有高滴度抗HBs的乙肝免疫球蛋白Ig)預防乙型肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白時因其半衰期短，故應注意有效期。34感謝你的觀看2019年8月29二、人工被動免疫人工被動免疫的制劑有免疫血清和丙種球蛋第三節(jié)病毒感染的治療一、抗病化學制劑（一）核苷類藥物核苷類藥物的作用機制有主要是抑制病毒基因復制①模擬核苷成分摻入病毒基因組：合成的異常嘧啶取代病毒DNA前體的胸腺嘧啶，病毒在復制過程中，這種異常的嘧啶分子摻入子代DNA中使子代病毒結(jié)構(gòu)基因的合成和表達無法進行，從而抑制病毒的復制，或復制出的病毒為缺陷病毒。②競爭病毒復制酶

35感謝你的觀看2019年8月29第三節(jié)病毒感染的治療一、抗病化學制劑35感謝你的觀看201.無環(huán)鳥苷(acyclovir,ACV，阿昔洛韋)和丙氧鳥苷（ganciclovirGCV，庚昔洛韋）為鳥嘌呤或脫氧鳥嘌呤核苷類似物。該藥細胞毒性很小，是目前最有效的抗皰疹病毒藥物之一。廣泛用于皰疹病毒感染引起的單純皰疹、生殖器皰疹及帶狀皰疹。36感謝你的觀看2019年8月291.無環(huán)鳥苷(acyclovir,ACV，阿昔洛韋)和丙氧2.疊氮胸苷(azidothymidine,AZT)胸腺嘧啶核苷類似物，通過阻斷前病毒DNA的合成而抑制HIV的復制，AZT對病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制比對細胞DNA多聚酶敏感100倍以上?？梢杂行У亟档虯IDS的發(fā)病率與病死率。耐藥株的出現(xiàn)系由基因突變導致逆轉(zhuǎn)錄酶具有耐藥性。因有抑制骨髓作用和形成病毒的耐藥而面臨被淘汰。37感謝你的觀看2019年8月292.疊氮胸苷(azidothymidine,AZT)373.病毒唑?qū)Χ喾NRNA和DNA病毒的復制都有抑制作用，但主要用于RNA病毒感染的治療，對細胞的核酸也有抑制作用。目前臨床主要用于流感病毒和呼吸道合胞病毒的治療。38感謝你的觀看2019年8月293.病毒唑38感謝你的觀看2019年8月29（二）病毒基因轉(zhuǎn)錄抑制劑這類核苷衍生物模擬天然二脫氧核苷底物，經(jīng)一系列磷酸化成為5’-三磷酸后，作為相似的底物競爭性抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性。被磷酸化的藥物分子與核苷酸分子相似，在RNA模板合成DNA過程中被嵌入DNA中。此DNA再轉(zhuǎn)錄時，由于其中的藥物分子不是正常的核苷酸，因而轉(zhuǎn)錄酶不能識別，從而使轉(zhuǎn)錄受阻。39感謝你的觀看2019年8月29（二）病毒基因轉(zhuǎn)錄抑制劑這類核苷衍生物模擬天然二脫氧核（三）非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑①nevirapine第1個新合成的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。1996年獲準用于治療HIV，耐藥株已出現(xiàn)，故建議與其它藥聯(lián)合使用；②pyridone作用類似nevirapine.40感謝你的觀看2019年8月29（三）非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑①nevirapine第1（四）蛋白酶抑制劑1．賽科納瓦(saquinavir)1995年批準的第1個蛋白酶抑制劑。2．英迪納瓦（indinavir）、瑞托納瓦（ritonavir）是1996年批準的新一代蛋白酶抑制劑，用于HIV。41感謝你的觀看2019年8月29（四）蛋白酶抑制劑1．賽科納瓦(saquinavir)19（五）其他抗病毒藥物1.金剛烷胺和甲基金剛烷胺金剛烷胺為合成胺類，甲基金剛烷胺是其衍生物，兩者有相同的抗病毒譜和副作用，能阻止脫殼，主要用于治療甲型流感。2.甲酸磷霉素無機焦磷酸鹽的有機類似物，抑制多種皰疹病毒，包括CMV、HSV、VZV、EBV、HHV6，可能還對HBV和逆轉(zhuǎn)錄病毒有作用。選擇性抑制病毒DNA多聚酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，而對宿主細胞無影響。42感謝你的觀看2019年8月29（五）其他抗病毒藥物1.金剛烷胺和甲基金剛烷胺金剛烷胺為二、干擾素和干擾素誘生劑的應用1.干擾素(IFN)具有廣譜抗病毒作用，毒性小，使用同種IFN無抗原性，主要用于甲、乙、丙型肝炎，HSV，乳頭瘤病毒和鼻病毒等感染的治療。反復應用也會引起耐藥性。2.IFN誘生劑如：polyI∶C、甘草甜