核桃分心木化學(xué)成分研究

核桃分心木化學(xué)成分研究

核桃心軸，又稱核桃內(nèi)膜，是堅(jiān)果科植物果核的干燥果皮膜。它是一種脆弱的外觀，薄而多彎曲。一般來說，堅(jiān)果的質(zhì)量為4%-5%。它是新疆彝族最古老的藥物之一，具有利尿、清熱、健脾、補(bǔ)腎、澀精等功效。近年來,有關(guān)核桃分心木單體化學(xué)成分研究的報(bào)道已有一些,主要采用柱色譜、高速逆流色譜等1儀器、試藥與儀器Waters2695型高效液相色譜儀(配有PDA檢測器,自動進(jìn)樣器,美國Waters公司);RIGOLL-3140型高效液相色譜儀(北京普源精電科技有限公司);Agilent1200RRLC-6410QQQ-MS/MS質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);YMC-PACKODS-A分析型色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);YMC-PACKODS-A半制備型色譜柱(250mm×10.0mm,5μm);VarianINOVA-400型核磁共振波譜儀(美國Varian公司);VarianINOVA-600型核磁共振波譜儀(美國Varian公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器R-3(瑞士Buchi公司);立式壓力滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司);倒置顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);NO檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。95%乙醇(分析純,淄博丹陽化工有限公司);石油醚、乙酸乙酯(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);甲醇(色譜純,OCEANPAKALEXATIVECHEMICAL.,Ltd);甲酸(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),高效液相用水(娃哈哈飲用水有限公司);二甲基亞砜(DMSO,北京索萊寶科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo公司);胎牛血清(FBS,美國CLARKBioscience公司);脂多糖(LPS,上海源葉生物科技有限公司)。分心木購于安徽亳州藥材市場,小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株購于美國ATCC公司。2實(shí)驗(yàn)方法2.1提取和分離2.1.1乙酸乙酯萃取部位粗提物的制備干燥后的核桃分心木藥材9kg,粉碎后于95%乙醇中回流提取2次,每次2h,料液比1∶4(w/v),趁熱抽濾,合并2次濾液,減壓蒸發(fā)至無醇味;石油醚萃取6次除去脂溶性成分,剩余水層用乙酸乙酯萃取6次,合并每部分萃取液,減壓濃縮干燥得乙酸乙酯萃取部位粗提物47.3g。根據(jù)前期研究結(jié)果2.1.2脫條件:1010min,分心木A2和C7餾分采用Waters2695型高效液相色譜分析,以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相,流速1mL/min,梯度洗脫(A2洗脫條件:0~10min,15%甲醇;10~11min,15%~30%甲醇;11~40min,30%~40%甲醇;波長:280nm;C7洗脫條件:0~5min,25%~30%甲醇;5~20min,30%甲醇;20~21min,30%~70%甲醇;21~40min,40%~50%甲醇;40~45min,50%甲醇;45~50min,50%~100%甲醇;波長:254nm),其高效液相色譜(HPLC)圖見圖3。2.1.3化合物的制備分心木A2餾分(600mg),經(jīng)反相C分心木C7餾分(40mg),通過半制備高效液相色譜分離,采用甲醇-水(50∶50,v/v)等度洗脫,得到化合物9(7.1mg)和10(7.2mg)。2.2抗炎活性實(shí)驗(yàn)2.2.1試驗(yàn)產(chǎn)品的制備取化合物1~10,分別用DMSO配制成50mM的溶液作為儲備液,加藥時(shí)用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋即可。2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取1mL培養(yǎng)基于標(biāo)準(zhǔn)品中,搖勻,依次稀釋成0、1、5、10、50、100μM的溶液,每孔加50μL,再加入等量的GriessΙ和GriessП試劑,用酶標(biāo)儀測定540nm處吸光度(OD值),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2.3no含量測定測定方法參考文獻(xiàn)篩選出具有較強(qiáng)NO抑制作用的樣品,分別稀釋成0.5、2.5、5、25、50μΜ的樣品溶液。采用MTT法,檢測各濃度化合物對RAW264.7細(xì)胞活力的影響,NO含量測定方法同2.2.3所述初篩方法。最后根據(jù)2.2.2繪制的NO標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算不同濃度樣品中NO含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件處理,并用x±s表示,組間差異用T-Test分析。3結(jié)果3.1化合物5的合成化合物1白色無定性粉末;ESI-MS:m/z208.1[M+H]化合物2白色結(jié)晶;ESI-MS:m/z183.1[M+H]化合物3白色無定性粉末;ESI-MS:m/z190.1[M+H]化合物4白色粉末;ESI-MS:m/z213.1[M+H]化合物5黃色粉末;ESI-MS:m/z617.1[M+H]化合物6黃色粉末;ESI-MS:m/z617.1[M+H]化合物7黃色粉末;ESI-MS:m/z465.1[M+H]化合物8黃色粉末;ESI-MS:m/z465.1[M+H]化合物9白色結(jié)晶;ESI-MS:m/z179.1[M+H]化合物10黃色粉末狀固體;ESI-MS:m/z303.0[M+H]3.2對細(xì)胞活力的影響對化合物1~10進(jìn)行抗炎活性篩選,結(jié)果顯示化合物10可顯著抑制炎癥細(xì)胞NO的釋放。通過MTT實(shí)驗(yàn)測各細(xì)