實(shí)驗(yàn)四聚丙烯酰胺凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)四聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆站郾０纺z電泳的原理及其應(yīng)用范圍；熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳相關(guān)緩沖液的配制方法。實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠簡(jiǎn)稱為PAGE為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native)及十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠(SDS)；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。而SDS僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。3.SDS是一種陰離子去污劑，具有變性和助溶特性，可按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，并打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，使SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響；4.SDS可使蛋白質(zhì)在Tris-甘氨酸(pH8.3)緩沖液中，通過電泳的方法分離不同分子量蛋白質(zhì)或測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)步驟相關(guān)溶液的制備30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr29g,甲叉雙丙烯酰胺（Bis）1g,加蒸餾水至100mL,過濾后置棕色瓶中，4°C貯存可用1-2月。10%SDS（十二烷基磺酸鈉）：10gSDS68C助溶于純水。1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris18.2g，加入50mL水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.8,最后用蒸餾水定容至100ml。1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris12.1g，加入50mL水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8,最后用蒸餾水定容至100mL10%過硫酸銨（AP）TEMED（四甲基乙二胺）2X樣品溶解液：1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）1mL,SDS200mg,B-巰基乙醇0.5mL（臨用前加入，也可以200mmol/L二硫蘇糖醇代替），漠酚藍(lán)3mg,甘油2mL,最后定容至10mL?？捡R斯亮藍(lán)染色液：取50%甲醇溶液90mL,冰乙酸10mL混勻，溶解稱取考馬斯亮藍(lán)R2500.25g（可適當(dāng)減少），過濾后備用。脫色液：甲醇300mL，冰乙酸100mL，蒸餾水定容至1L。5XTris-甘氨酸電泳緩沖液（pH8.3）：稱Tris15.1g,甘氨酸94g,加入50mL10%SDS，加蒸餾水使其溶解后定容至1L。（二）制膠過程

1.配制分離膠溶液（以12%5mLPAGE為例）凝膠配制過程要迅速，催化劑TEMED要在注膠前再加入。注膠過程要一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。2.配制濃縮膠溶液（以5%3mLPAGE為例）濃縮膠，也成為積層膠，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低，導(dǎo)電性較低，由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，在濃縮膠內(nèi)便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，導(dǎo)電性高，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白根據(jù)其分子大小進(jìn)行分離

（三）樣品處理、電泳、染色及脫色樣品處理：在濃縮膠聚合時(shí)，將2X凝膠上樣緩沖液與待電泳樣品混合，煮沸3min,使蛋白變性。電泳：待濃縮膠聚合完成后（約30min），拔下梳子，以蒸餾水充分沖洗加樣孔，加入適量樣品（約15^L），無樣品泳道以1X凝膠上樣緩沖液加入，將電泳裝置與電源連接（注意紅色正極加入下槽），先按照8V/cm電壓（10mA）使樣品在濃縮膠中泳動(dòng)，待漠酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，加大電壓到15V/cm（20mA），直至漠酚藍(lán)進(jìn)入分離膠底部（約4h），停止電泳。染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入考馬斯亮藍(lán)染色液染色1小時(shí)左右。脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。（四） 結(jié)果分析相對(duì)遷移率二蛋白樣品距加樣端遷移距離（cm）漠酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離（cm）以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量。標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。（五） 注意事項(xiàng)Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用，操作時(shí)應(yīng)戴手套和口罩。玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃板之間產(chǎn)生氣泡。樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。灌凝膠時(shí)不能有氣泡，以