分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)技術(shù)操作

#-加入400uL的酚-氯仿-異戊醇，搖勻后靜置幾分鐘(5?lOmin),不宜劇烈。12000rpm離心lOmin。小心將上清取出，加入兩倍體積以上(780uL即可)的無水乙醇和終濃度為0.2M的NaAc(40uL),置于液氮中3min。小心不要吸入中間的蛋白和下層的酚相*取出后可先置于-20°C中放2分鐘以防止管子爆裂。12000rpm離心lOmin。迅速棄去無水乙醇，再用無水乙醇洗一下(也可不洗)，最好用滅菌槍頭吸干管內(nèi)液體*在恒溫器(55C)干燥5min左右至無乙醇?xì)馕?，再加?0uLddH2O溶解。-20C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?使用時(shí)不要頻繁的反復(fù)凍融)*操作過程中要嚴(yán)防污染**做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*哺乳動(dòng)物細(xì)胞單克隆株分離：把轉(zhuǎn)染72hr后的細(xì)胞從六孔板中的用Verson液消化洗下，經(jīng)稀釋后轉(zhuǎn)入50mL螺口玻璃培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至基本貼壁時(shí)再加入含作用濃度為4OOug/mLG4l8的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以2?3天為間隔換液，如此培養(yǎng)一星期后可觀察到有大量細(xì)胞死亡，相應(yīng)降低G418壓力繼續(xù)培養(yǎng)2?3星期后，可觀察到有細(xì)胞克隆形成。將已形成細(xì)胞克隆的培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察克隆的位置，并用記號(hào)筆將其標(biāo)出用鑷子夾取滅菌過的小濾紙片，在Verson中蘸濕后將其覆蓋在細(xì)胞克隆上，5?20s后取出在加有完全培養(yǎng)基(600uL/孔)的24孔板中刷洗數(shù)次，將附著上的細(xì)胞洗下。將轉(zhuǎn)移有細(xì)胞克隆的24孔板置于5%C02培養(yǎng)箱中37C進(jìn)行培養(yǎng)。待24孔板中的細(xì)胞生長并達(dá)到80%以上滿底后，分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測。將經(jīng)檢測可表達(dá)目的基因的細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)入50mL螺口培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候進(jìn)行傳代換液，擴(kuò)增細(xì)胞，進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。常用溶液、培養(yǎng)基配制LB培養(yǎng)基：每lOOOmL加分析純NaCllOg,蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH0配制，再用10M2NaOH調(diào)pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高壓蒸汽滅菌15min冷卻后使用。固體培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入瓊脂至1.5%，咼壓滅菌后使用。溶液I：葡萄糖50mmol/L，EDTA10mmol/L，Tris-HCl25mmol/L，pH8.0。溶液II：NaOH0.2mol/L，SDS1%，用ddH2O現(xiàn)配現(xiàn)用。溶液III:取5mol/LNaAc60mL，冰乙酸11.5mL，混合后加ddH2O至lOOmL。0.1mol/LCaCl2:在適量純水中溶解54gCaCl2.6H2O，定容至100mL，高壓除菌后保存于4°C備用。Tris-飽和酚：因?yàn)樵谒嵝詶l件下DNA分配于有機(jī)相，因此使用前必須對(duì)重蒸酚進(jìn)行平衡，使其pH值在7.8以上。將保存于-20C的重蒸酚取出置室溫，68C水浴使其溶解，加0.1%8-羥基喹啉，再加入等體積l.Omol/1(pH8.0)的Tris-Cl。《分子克隆》推薦磁力攪拌60min，靜置15min分層后測pH值，若距pH7.8偏差太大，再更換加入等體積的1.0mol/lTris-Cl，繼續(xù)攪拌后檢測酚液的pH變化，若仍達(dá)不到7.8，則再更換加入等體積1.0mol/lTris-Cl(pH8.0)，重復(fù)上述操作，直到pH接近或大于7.8。再更換加入等體積0.1mol/lTris-Cl(pH8.0)，重復(fù)上述操作后靜置將酚液分裝入棕色玻璃瓶，表面覆一層Tris-Cl水相，以防止酚的氧化，并維持酚液pH值，4C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)室做法是：先用等體積的1.0mol/lTris-Cl磁力攪拌2hr，靜置分層后測酚相pH值，若達(dá)不到7.8，則加入30gTris干粉，繼續(xù)攪拌1hr后測pH值，若仍未靠近7.8，再加入10-15g30gTris干粉繼續(xù)攪拌，可攪拌過夜，一般平衡1000mL酚液需加入40-45gTris干粉，攪拌至pH接近或大于7.8。再更換加入等體積O.1mol/lTris-Cl(pH8.0)，繼續(xù)攪拌1-2hr后靜置分層，將酚液分裝入棕色玻璃瓶，表面覆一層Tris-Cl水相，4C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?氯仿-異戊醇(25:24:1):以25：24：1的比例混勻平衡酚、氯仿、異戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一層Tris-Cl水相，4C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。瓊脂糖凝膠加樣緩沖液:0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲本青FF,40%(w/v)蔗糖水溶液TE緩沖液:10mmol/LTris-Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，滅菌后使用。實(shí)驗(yàn)室中配有100X的TE母液，用時(shí)可用ddH2O稀釋成1X使用液，滅菌后使用。無DNA酶