離體培養(yǎng)法培養(yǎng)曼陀羅毛狀根中東堿和堿的含量

離體培養(yǎng)法培養(yǎng)曼陀羅毛狀根中東堿和堿的含量

梅莉亞甲基酯（mj）是一種由素木蘭花中的有香味化合物，也是茉莉花中獨特的香料，在其他植物中也廣泛分布。研究發(fā)現(xiàn)它在植物細胞的多種逆境反應(yīng)中起信號介導(dǎo)的作用,引起細胞抗逆反應(yīng)產(chǎn)物的表達,并能作為誘導(dǎo)子(elicitors)誘導(dǎo)曼陀羅、丹參等物種毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的積累和釋放。曼陀羅DaturastramoniumL.是茄科曼陀羅屬植物,又叫曼荼羅、滿達、曼扎、曼達、醉心花、狗核桃、洋金花、楓茄花、萬桃花、鬧羊花、大喇叭花、山茄子等,多野生在田間、溝旁、道邊、河岸、山坡等地方,原產(chǎn)印度。曼陀羅原產(chǎn)熱帶及亞熱帶,我國各省均有分布。喜溫暖、向陽及排水良好的砂質(zhì)壤土。主要藥用成分為具有抗膽堿特性的莨菪堿(hyoscyamine)、東莨菪堿(scopolamine)及阿托品(atropine)等生物堿,具有解痙鎮(zhèn)痛、麻醉鎮(zhèn)靜、止咳平喘、擴張毛細血管、改善微循環(huán)以及抗暈船暈車等功效。隨著對東莨菪堿藥理作用的深入研究和廣泛用于臨床鎮(zhèn)靜、戒毒脫癮、治療麻痹癥、暈動癥、胃腸痙攣性絞痛、三叉神經(jīng)痛和有機磷農(nóng)藥中毒等,在原有巨大市場基礎(chǔ)上,其需求還在迅速增長。近年來,國內(nèi)外對許多藥用植物通過誘導(dǎo)子刺激毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的迅速積累培養(yǎng)體系的建立獲得一些珍貴的天然次生代謝產(chǎn)物的研究,獲得了令人鼓舞的結(jié)果。Zabetakis等比較了在曼陀羅毛狀根培養(yǎng)中添加MJ、真菌誘導(dǎo)子(酵母細胞壁,YE)和寡半乳糖醛酸(oligogalacturonides)的誘導(dǎo)效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MJ能增加茛菪堿的合成,是所用的3種誘導(dǎo)子中誘導(dǎo)效果最好的。Pitta-Alvarez等考查了不同的生物(SA,YE)和非生物(CaCl2,AgNO3,CdCl2)誘導(dǎo)子對曼陀羅毛狀根中茛菪堿生產(chǎn)的影響,結(jié)果表明所選用的生物和非生物誘導(dǎo)子都能不同程度地提高茛菪堿的產(chǎn)量。Furze等報道在曼陀羅毛狀根中添加7種真菌的培養(yǎng)提取物和非生物誘導(dǎo)子(重金屬鹽類)都不能提高其次生代謝產(chǎn)物茛菪堿的產(chǎn)量,但非生物誘導(dǎo)子卻誘導(dǎo)了倍半萜類植保素的合成,這是在未誘導(dǎo)的毛狀根中不能檢測到的物質(zhì)。誘導(dǎo)子還被報道可以在不損失毛狀根活力和生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物能力的前提下促進產(chǎn)物從毛狀根中釋放到培養(yǎng)液中。例如Pitta-Alvarez等報道在曼陀羅毛狀根中添加CuSO4后的24,48h時,CuSO4的主要作用就是促進了天仙子堿和天仙子胺向培養(yǎng)基中釋放。Furze等報道的真菌提取物和重金屬鹽雖然都不能提高茛菪堿的含量,但是可以增加茛菪堿釋放到培養(yǎng)液中的含量。本試驗采用外源性誘導(dǎo)子———茉莉酸甲酯作用于曼陀羅毛狀根的研究對獲得價格昂貴的天然藥物東莨菪堿、莨菪堿具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。1材料表面1.1甲醇甲醇島津LC-20AD自動進樣高效液相色譜儀;培英大容量全溫振蕩器;色譜柱Symmetry-C18(4.6mm×150mm,5μm);三重蒸餾水、色譜純甲醇、三乙胺、氨水、乙醇、乙醚、氯仿、二氯甲烷、甲醇均購置于重慶川東化工(集團)有限公司;莨菪堿和氫溴酸東莨菪堿對照品分別購于蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司和國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心(HPLC≥98%)。1.2pra4質(zhì)粒而成發(fā)根農(nóng)桿菌pra感染曼不同菌株外植體獲得本試驗所用曼陀羅毛狀根是采用葉盤法,用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1菌種(C58C1是根癌農(nóng)桿菌經(jīng)“Disarmed”改造后,保留Helper質(zhì)粒,導(dǎo)入pRiA4質(zhì)粒而成的發(fā)根農(nóng)桿菌)感染曼陀羅無菌外植體獲得。當(dāng)毛狀根生長至3cm左右時,剪下不同的單克隆分別接種于含500mg·L-1的頭孢噻肟鈉的1/2MS固體培養(yǎng)基中,每7d剪取毛狀根的根尖繼代培養(yǎng),繼代5~6次后,將毛狀根轉(zhuǎn)移至YEB瓊脂培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)7d,檢測毛狀根無農(nóng)桿菌污染后,接種于裝有100mL1/2MS液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中作為試驗材料,110r·min-1,27℃震蕩培養(yǎng)。1.3無水乙醇用量的制備茉莉酸甲酯購自上海三踏生物技術(shù)有限公司(批號20073-13-6),以無水乙醇為助溶劑,配置母液,過0.22μm濾膜除菌,加入100mL1/2MS液體培養(yǎng)基中,使MJ終濃度分別為100,150,200,250,300μmol·L-1。2方法2.1誘導(dǎo)測試2.1.1毛狀根的誘導(dǎo)誘導(dǎo)向繼代培養(yǎng)18d的曼陀羅毛狀根液體培養(yǎng)基中添加濃度分別為100,150,200,250,300μmol·L-1的MJ進行誘導(dǎo)處理,設(shè)置3個重復(fù),每天觀察毛狀根的生長狀況,每隔3d收獲1次,測定毛狀根鮮重、干重和東莨菪堿、莨菪堿含量。2.1.2jmj的誘導(dǎo)處理向繼代培養(yǎng)18d的曼陀羅毛狀根液體培養(yǎng)基中添加MJ(MJ所用濃度由濃度梯度試驗決定)進行誘導(dǎo)處理,設(shè)置3個重復(fù),分別于處理0,3,6,9,12d后收獲,測定毛狀根鮮重、干重和東莨菪堿、莨菪堿含量。2.2曼不同培養(yǎng)物的鮮重增殖選取生長旺盛的曼陀羅毛狀根,按定量接種法接入裝有100mL1/2MS液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中110r·min-1,27℃震蕩培養(yǎng),每三角瓶的接種量約為0.05g(FW)。在為期33d培養(yǎng)過程中,每隔3d隨機抽取毛狀根培養(yǎng)物3瓶(在誘導(dǎo)試驗中,根據(jù)處理時間需要進行毛狀根鮮重、干重的測定),用蒸餾水沖洗去培養(yǎng)物上的殘留液體培養(yǎng)基,并用吸水紙吸干水分后進行毛狀根的鮮重測量。并按如下公式計算毛狀根培養(yǎng)物的鮮重增殖倍數(shù),毛狀根培養(yǎng)物鮮重增殖倍數(shù)=(收獲鮮重-接種鮮重)/接種鮮重,同時繪制曼陀羅毛狀根在不同液體培養(yǎng)基中的生長曲線圖。將稱量過鮮重的新鮮的毛狀根樣品于60℃烘箱中烘干(或使用真空干燥泵)至恒重,測定毛狀根干重,并按如下公式計算毛狀根培養(yǎng)物的干重增殖倍數(shù),毛狀根培養(yǎng)物干重增殖倍數(shù)=(收獲干重-接種干重)/接種干重。2.3ww提取液制備分別準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的不同曼陀羅毛狀根系約0.1g,置具塞錐形瓶中,準(zhǔn)確加入濃氨水-乙醇-乙醚(4∶5∶10)溶液9.5mL,搖勻、密塞,室溫放置12h,常溫下超聲(100W)提取2次,每次30min,1萬r·min-1離心5min,收集上清液,殘渣用10mL提取液洗滌,合上清液和洗液,于60℃水浴上蒸干。殘渣用1mL0.5mol·L-1硫酸溶解,超純水洗滌,轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,用氯仿萃取3次萃取體積為10,5,5mL,每次萃取后棄去氯仿層,水層用0.5mol·L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8~9,再用氯仿萃取3次(10,5,5mL),收集合并氯仿液,在水浴上蒸去氯仿,殘渣用超純水溶解并定容至5mL,13000r·min-1離心10min,上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾,用于HPLC測定。2.4-二氯甲烷-3-甲基-3-甲基-2-硫基苯磺酸h將收獲的100mL曼陀羅毛狀根液體培養(yǎng)基用稀鹽酸將培養(yǎng)液的pH調(diào)至2~3,分別用等體積的二氯甲烷提取2次去雜質(zhì),再將水相用氨水調(diào)至pH9~10,用等體積的二氯甲烷提取2次,合并溶劑,蒸干后用甲醇溶解并定容至1mL,過0.22μm微孔濾膜,即得。2.5東堿、堿含量測定島津LC-20AD自動進樣高效液相色譜儀;莨菪堿和氫溴酸東莨菪堿對照品分別購于蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司和國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心(HPLC≥98%)。色譜條件:色譜柱Symmetry-C18(4.6mm×150mm,5μm);流動相甲醇-水(20∶80),水中含0.02mol·L-1醋酸鈉溶液、0.02%三乙胺,用醋酸調(diào)pH至6.0;流速1.0mL·min-1;檢測波長215nm;柱溫30℃。在該色譜條件下對曼陀羅毛狀根中東莨菪堿、莨菪堿進行含量測定,同時準(zhǔn)確稱取東莨菪堿和莨菪堿5mg,用超純水稀釋成0.5g·L-1母液,1萬×g離心10min,分別進樣1,2,4,8,16μL,記錄相應(yīng)的峰面積,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。東莨菪堿和莨菪堿的標(biāo)準(zhǔn)峰圖見圖1,以進樣體積和峰面積之間的關(guān)系,得出東莨菪堿測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=4.492×105X-7496.2,R2=0.9999;莨菪堿測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=4.819×105X-15176,R2=0.9999,X為相對進樣體積,Y為峰面積。3結(jié)果與分析3.1曼不同生長階段毛狀根誘導(dǎo)效果曼陀羅毛狀根培養(yǎng)約27d左右,毛狀根達到生長高峰,毛狀根鮮重達到7.275g,干重達到0.709g,在30d達生長穩(wěn)定期,毛狀根的干物質(zhì)含量不再增加,反而出現(xiàn)下降現(xiàn)象,經(jīng)檢測,毛狀根在培養(yǎng)27d左右毛狀根中東莨菪堿和莨菪堿的合成量分別達到0.368,1.146mg·g-1,毛狀根生長的穩(wěn)定期后東莨菪堿和莨菪堿合成明顯減慢,且含量降低,因而100mL液體培養(yǎng)27d左右是曼陀羅毛狀根收獲的最佳時期,在培養(yǎng)18d后,即毛狀根由遲緩期開始進入快速生長時進行誘導(dǎo)試驗效果最佳,見圖2。3.2對曼不同濃度mj培養(yǎng)的培養(yǎng)基中毛狀根生長的影響向繼代培養(yǎng)18d的曼陀羅毛狀根液體培養(yǎng)基中添加濃度分別為100,150,200,250,300μmol·L-1的MJ進行誘導(dǎo)處理,每天觀察毛狀根的生長形態(tài)和變化,隨著培養(yǎng)時間的延長,各種MJ濃度培養(yǎng)下的曼陀羅毛狀根在培養(yǎng)6d時根尖都逐漸不同程度變黃;培養(yǎng)9d時根尖明顯出現(xiàn)不同程度褐化現(xiàn)象,表明根體開始老化;而培養(yǎng)12d的毛狀根根體均發(fā)黑,毛狀根主側(cè)根都很少伸長,側(cè)根稀疏且?guī)缀醪辉匍L出新的側(cè)根,整個毛狀根系呈松針狀,質(zhì)地變軟(糊粉化),表現(xiàn)出較明顯的生長抑制。與對照(不添加MJ培養(yǎng)9d的曼陀羅毛狀根)相比,分別用濃度為100,150,200,250μmol·L-1MJ處理的毛狀根出現(xiàn)不同程度的褐化;而300μmol·L-1濃度培養(yǎng)的毛狀根根體發(fā)黑,表現(xiàn)出較明顯的生長抑制,見圖3。與對照(不添加MJ培養(yǎng)9d的曼陀羅毛狀根)相比,不同濃度MJ處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的毛狀根鮮重和干重都明顯低于對照,其鮮重增殖倍數(shù)和干重增殖倍數(shù)分別僅為同期對照毛狀根的70.3%,65.1%,71.5%,42.8%,29.8%和39.3%,35.7%,38.8%,32.0%,23.7%,這表明不同濃度的MJ均有抑制曼陀羅毛狀根生長的作用,見圖4。在5個濃度處理中,用200μmol·L-1MJ進行誘導(dǎo)處理的毛狀根的鮮重增殖倍數(shù)為71.5%,均高于其他幾個處理,干重增殖倍數(shù)為38.8%,僅略次于100μmol·L-1處理的干重增殖倍數(shù)(39.3%),因此考慮用濃度為200μmol·L-1的MJ進行時間梯度誘導(dǎo)處理。3.3濃度對毛狀根釋放堿的影響與對照(不添加MJ培養(yǎng)9d的曼陀羅毛狀根)相比,濃度為100,150,200μmol·L-1MJ處理的毛狀根積累的東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.449,0.413,0.431mg·g-1,均高于對照0.368mg·g-1;而在5個濃度處理中,200μmol·L-1濃度培養(yǎng)的毛狀根向培養(yǎng)基中釋放的東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,達0.594mg·g-1。因此用濃度為200μmol·L-1MJ處理的毛狀根產(chǎn)生的總東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.026mg·g-1,高于對照0.990mg·g-1和其他濃度梯度處理,見圖5。與對照(不添加MJ培養(yǎng)9d的曼陀羅毛狀根)相比,濃度為100,150,200,250,300μmol·L-1MJ處理的毛狀根積累的莨菪堿含量均低于對照1.146mg·g-1,且隨著濃度的升高產(chǎn)生的莨菪堿含量反而降低,呈負相關(guān);而在5個濃度處理中,只有200,300μmol·L-1濃度培養(yǎng)的毛狀根向培養(yǎng)基中釋放莨菪堿。因此,用濃度為200μmol·L-1MJ處理的毛狀根產(chǎn)生的總莨菪堿含量最高為1.158mg·g-1,見圖6。綜合茉莉酸甲酯各濃度對曼陀羅毛狀根生長和毛狀根生物堿積累、釋放的影響,確定茉莉酸甲酯濃度為200μmol·L-1。3.4生長穩(wěn)定期毛狀根干物質(zhì)含量的變化曼陀羅毛狀根培養(yǎng)約27d(9d對照)左右,毛狀根達到生長高峰,毛狀根鮮重達到7.2745g,干重達到0.7091g,在30d(12d對照)達生長穩(wěn)定期,毛狀根的干物質(zhì)含量不再增加,反而出現(xiàn)下降現(xiàn)象,呈現(xiàn)在培養(yǎng)18d(0d對照,CK)開始先增長后降低的趨勢;而用濃度為200μmol·L-1的MJ對曼陀羅毛狀根誘導(dǎo)處理,6d左右,毛狀根提前達到生長高峰,毛狀根鮮重達到4.1976g,干重達到0.4149g,也呈現(xiàn)出0d開始先增長后降低的趨勢,除了處理3d時的毛狀根干、鮮重均高于對照外,其余用MJ處理的毛狀根干、鮮重均明顯低于未添加MJ的對照毛狀根干、鮮重,見圖7。3.5曼不同時期東堿含量的變化經(jīng)檢測,毛狀根在培養(yǎng)27d(9d對照)左右毛狀根中東莨菪堿和莨菪堿的合成量達最高值,分別達到0.368,1.146mg·g-1,毛狀根生長的穩(wěn)定期后東莨菪堿和莨菪堿合成減慢,且含量降低,呈現(xiàn)出0d開始先增長后降低的趨勢。MJ處理后作用結(jié)果見表1,經(jīng)過MJ處理后東莨菪堿含量迅速上升,處理后3d東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)達0.419mg·g-1,是同時期對照組的1.36倍;處理后6d東莨菪堿達0.439mg·g-1,是同時期對照組的1.42倍;處理后9d東莨菪堿達0.431mg·g-1,是同時期對照組的1.17倍;處理后12d東莨菪堿達0.374mg·g-1,是同時期對照組的1.12倍。經(jīng)過MJ處理后莨菪堿含量在短時間(處理后3d)迅速上升,質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.493mg·g-1,是同時期對照組的2.28倍;處理9d后含量低于同時期對照組,呈現(xiàn)出處理3d開始一直降低的趨勢。分析結(jié)果表明,曼陀羅毛狀根MJ處理之后東莨菪堿在短時間內(nèi)迅速積累,與同時期對照組比較,東莨菪堿含量均增大,最大增幅達1.42倍(處理后6d)。莨菪堿含量呈現(xiàn)出從處理3d開始一直降低的趨勢,僅在處理3d時莨菪堿高于同時期對照組2.28倍。3.6東堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)MJ對曼陀羅毛狀根東莨菪堿、莨菪堿釋放的影響,實驗結(jié)果表明,用MJ處理3,6,12d后培養(yǎng)基中的東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)達0.456,0.872,0.529mg·g-1,與對照組比較,增加了1.13,1.46,1.36倍,處理9d的東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)達0.594mg·g-1,略低于對照組0.621mg·g-1。處理3,6,9d后培養(yǎng)基中莨菪堿達0.598,0.435,0.434mg·g-1,未經(jīng)處理的正常培養(yǎng)組(對照組)培養(yǎng)基和處理12d培養(yǎng)基中未檢測到莨菪堿成分,見表2。證明MJ能有效刺激曼陀羅毛狀根中東莨菪堿、莨菪堿成分的迅速積累并向培養(yǎng)基中釋放。3.7氨基乙酸鈉對曼陀羅毛狀根總ch-w的影響4東堿的積累和釋放通過實驗首次證明了茉莉酸甲酯能有效提高莨菪烷類生物堿成分在曼陀羅毛狀根中的積累并刺激其向培養(yǎng)基中釋放。從實驗結(jié)果可知,曼陀羅毛狀根中,經(jīng)MJ處理后6d,東莨菪堿是同時期對照組的1.42倍;MJ處理后6d,培養(yǎng)基中東莨菪堿是同時期對照組的1.46倍。經(jīng)MJ處理后3d,莨菪堿是同時期對照組的2.28倍;MJ處理后3d,培養(yǎng)基中莨菪堿含量達0.598mg·g-1,而對照組培養(yǎng)基中未檢測到莨菪堿成分。已經(jīng)證明,東莨菪堿是莨菪堿氧化產(chǎn)物,反應(yīng)向東莨菪堿形成的方向進行,莨菪堿氧化過程不是可逆的。催化莨菪堿氧化形成山莨菪堿進而形成東莨菪堿的莨菪堿6-羥基化酶已經(jīng)克隆,該酶催化有兩步反應(yīng),并用于轉(zhuǎn)基因顛茄提高了東莨菪堿的含量。本試驗中,用MJ處理后莨菪堿的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢與東莨菪堿含量的增加和莨菪堿含量的下降同步說明MJ促進曼陀羅毛狀根將形成的莨菪堿氧化成東莨菪堿。上述結(jié)果還表明,在液體培養(yǎng)的毛狀根中莨菪堿和東莨菪堿的積累量增加倍數(shù)都不太高,而經(jīng)MJ處理后,培養(yǎng)液中東莨菪堿和莨菪堿含量的增加倍數(shù)較高,說明MJ有利于東莨菪堿和莨菪堿成分向培養(yǎng)基中釋放;且在對照實驗中培養(yǎng)液中不能檢測到莨菪堿含量,但可以檢測到東莨菪堿含量,經(jīng)MJ處理后,培養(yǎng)液中東莨菪堿和莨菪堿含量在一定時間內(nèi)顯著增加,這可能由于東莨菪堿被分泌到培養(yǎng)液中,產(chǎn)物的移出使莨菪堿的轉(zhuǎn)化反應(yīng)持續(xù)進行,這對于曼陀羅毛狀根系統(tǒng)形成東莨菪堿的實際應(yīng)用將是十分有利的,不僅可以提高產(chǎn)率,而且有利于東莨菪堿的分離提取。用濃度為200μmol·L-1的MJ對曼陀羅毛狀根誘導(dǎo)處理6d左右,毛狀根提前達到生長高峰,呈現(xiàn)出0d開始先增長后降低的趨勢,除了處理3d時的毛狀根干、鮮重均高于對照外,其余用MJ處理的毛狀根干、鮮重均明顯低于未添加MJ的對照毛狀根干、鮮重。這可能是由于MJ作為一種外源刺激,激發(fā)了植物細胞的多種逆境反應(yīng),引起細胞抗逆反應(yīng)產(chǎn)物的表達,促使毛狀根由初生代謝更快地轉(zhuǎn)變?yōu)榇紊x途徑,從而抑制了毛狀根的生長。誘導(dǎo)子作為一種外界信號,可以被曼陀羅毛狀根細胞膜上的受體所識