高效液相色譜法測定牡丹皮中丹皮酚的含量

高效液相色譜法測定牡丹皮中丹皮酚的含量

牡丹皮是牡丹科植物的干燥根皮。它有辛、苦、淡寒。具有清熱涼血、活血化瘀的功效。牡丹皮中以揮發(fā)油類成分為主,丹皮酚為其有效成分,因此對牡丹皮的質(zhì)量控制多以丹皮酚的含量作為標(biāo)準(zhǔn)。從臨床應(yīng)用以及藥材采購環(huán)節(jié)了解到,牡丹皮新貨價格比陳貨要高得多,本實驗通過高效液相色譜(HPLC)法評價不同產(chǎn)地及同一產(chǎn)地不同年份牡丹皮中丹皮酚的含量,為臨床用藥和藥材采購提供一定的依據(jù)。1儀器和試劑盒1.1儀器高效液相色譜儀(LC-10ATvp高壓泵,島津SPD-10Avp紫外檢測器),Sartorius-CP225D分析天平。1.2色譜純的方法丹皮酚對照品購于中國藥品生物制品檢定所,甲醇為色譜純,水為純凈水,醋酸為分析純。牡丹皮來源:安徽牡丹皮新貨、安徽牡丹皮3年貨、山東牡丹皮3年貨及山東牡丹皮6年貨均購于河北安國藥材市場。2方法和結(jié)果2.1對照品溶液的配制精密稱取丹皮酚對照品5mg,置10ml的量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,精密量取0.4ml,置10ml量瓶中,制成濃度為0.02mg/ml的對照品溶液。2.2超聲提取法取樣品粗粉0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50ml,密塞,搖勻,稱定重量,在50℃下超聲提取20min,放冷,再稱定,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液1ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。2.3流動相色譜柱為DiamonsilC18柱(4.6mm×200.0mm,5.0μm),流動相為甲醇-醋酸-水(54∶2∶44),流速1ml/min,檢測波長274nm。對照品及樣品HPLC圖見圖1～5。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取上述10ml對照品溶液(0.5mg/ml)中吸取0.1、0.2、0.4、1.0、2.0ml置10ml容量瓶中,按上述色譜條件測定峰面積,以峰面積為橫坐標(biāo),丹皮酚含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=49133.13X+129877.20,r=0.9996,濃度在5.1～102.0μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.5精密度測試精密量取對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄保留時間和峰面積,精密度(RSD)為2.25%,結(jié)果表明本方法精密度良好。2.6超聲提取法取同一批安徽牡丹皮藥材粗粉5份,精密稱定,取粗粉0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入溶劑50ml,密塞,搖勻,稱定重量,超聲提取,放冷,再稱定,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液1ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。分別進(jìn)樣,記錄保留時間和峰面積,RSD為1.40%,結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好,。2.7峰面積積分實驗精密吸取供試品溶液,分別于配制后0、2、4、8、12h測得丹皮酚峰面積積分值,RSD為0.44%,表明在室溫下,樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.8加樣回收率和精密度精密稱定已測定含量的安徽牡丹皮新貨干燥藥材粗粉6份,每份約0.5g,精密稱定對照品10.2mg,加入藥材粉末中,按“2.2”項下方法和色譜條件測定峰面積積分值,測得丹皮酚的平均回收率為99.4%,RSD為0.94%,見表1。2.9個樣本丹皮酚含量的測定分別精密吸取上述供試品溶液適量,注入液相色譜儀,記錄峰面積,計算含量及RSD值。見表2。選取安徽牡丹皮新貨貨、安徽牡丹皮3年貨、山東牡丹皮3年貨、山東牡丹皮6年貨的樣品數(shù)據(jù)作比較,測得4個樣本各樣品中丹皮酚的含量屬于隨機(jī)變量,符合正態(tài)分布。對4組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,比較各組之間的差異性,結(jié)果顯示,安徽牡丹皮3年貨樣品中丹皮酚的含量高于山東牡丹皮3年貨,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);安徽牡丹皮新貨樣品中丹皮酚的含量和安徽牡丹皮3年貨、山東牡丹皮3年貨、山東牡丹皮6年貨比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。3討論3.1提取條件的篩選依據(jù)文獻(xiàn)方法,從提取溶劑、提取時間、提取溫度3個因素對提取條件進(jìn)行篩選。采用正交試驗方法進(jìn)行比較,最后得出以甲醇作為溶劑,在50℃下超聲提取20min為最佳提取條件。3.2丹皮酚溶液的用量依據(jù)文獻(xiàn)方法,試驗了不同體系的流動相,發(fā)現(xiàn)以甲醇-醋酸-水溶液為流動相時丹皮酚的分離效果最好。由于丹皮酚易溶于甲醇中,在熱水中溶解,不溶于冷水,因此在反相色譜中隨著甲醇量的減少,保留時間會延長。此外,醋酸的加入使峰型變得美觀。后對甲醇-醋酸-水溶液的比例進(jìn)行了調(diào)整,經(jīng)反復(fù)比較,最后選定甲醇-醋酸-水(54∶2∶44)為流動相。3.3神經(jīng)酶測定與存放時間的關(guān)系本研究結(jié)果顯示,安徽和山東的牡丹皮中丹皮酚含量有很大差別。此外,同一產(chǎn)地不同年份的牡丹皮中丹皮酚含量亦有顯著差異,表明丹皮酚的含量與存放時間有關(guān),存放時間越長丹皮酚的含量越低。綜上所述,本文建立了測定牡丹皮中主要化學(xué)成分丹皮酚含量的HPLC法,對不