少孢根霉gim31921發(fā)酵全程防腐劑的工藝研究

少孢根霉gim31921發(fā)酵全程防腐劑的工藝研究

腐爛是一種具有中國特色的食品。在其發(fā)酵過程中,前酵為培菌過程,即菌種分泌蛋白酶、脂肪酶等酶系,以利于后酵各酶系的協(xié)同作用。腐乳發(fā)酵全過程的一個顯著特征就是產(chǎn)生以蛋白酶為主的酶系,使其具有質(zhì)地細(xì)膩、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富、易消化吸收等特點。然而不同發(fā)酵菌種制得的腐乳質(zhì)地、風(fēng)味和營養(yǎng)等各不相同。以少孢根霉為菌種發(fā)酵大豆而成的食品謂之丹貝,因其營養(yǎng)豐富,蛋白利用率高深受東南亞等國人民的青睞。尤其是該菌發(fā)酵的豆制品,使其中的異黃酮大量轉(zhuǎn)化為具有多種抗病、保健功效的生物活性成分———活性異黃酮,而且符合現(xiàn)代人們養(yǎng)生保健的理念。劉欣等報道少孢根霉、雅致放射毛霉和五通橋毛霉三菌種發(fā)酵腐乳異黃酮的含量,以少孢根霉聚首,說明該菌種發(fā)酵制得的腐乳營養(yǎng)品位上成;孫興民等對少孢根霉RT-3株發(fā)酵腐乳的前酵工藝、蛋白酶活力和氨基酸態(tài)氮的含量測定等進(jìn)行了報道;本研究則以少孢根霉GIM3.381為菌種發(fā)酵腐乳,并以蛋白酶活力為該菌發(fā)酵代謝各指標(biāo)的表征指標(biāo),對其發(fā)酵工藝的前酵給予探索、優(yōu)化;對發(fā)酵全程的質(zhì)構(gòu)特性、成熟期的主要參數(shù)亦予檢測。此為開發(fā)該菌發(fā)酵、且兼?zhèn)錉I養(yǎng)保健雙重功效的豆類制品奠定研究基礎(chǔ)。1材料和方法1.1儀器、試劑與儀器少孢根霉GIM3.381購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心;新鮮北大荒老豆腐、黃酒、食鹽、紅曲米、面糕曲、馬鈴薯及糖精市售;葡萄糖、氯化鈉、干酪素、氫氧化鈉、三氯乙酸、乳酸、碳酸鈉、硝酸銀、鉻酸鉀、甲醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、福林酚試劑、瓊脂天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,分析純。TE124S型電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋、GRX-9073A型空氣消毒箱、DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;PB-10型pH計北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;低速自動平衡離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠;TGL-16G型臺式離心機(jī)上海安享科學(xué)儀器廠;722型可見分光光度計上海元析儀器有限公司;氣動恒溫?fù)u床上海智誠分析儀器制造有限公司;TA-XTplus型質(zhì)構(gòu)分析儀英國StableMicroSystems公司;BCD-256DT型冰箱青島海爾有限公司。1.2實驗方法1.2.1準(zhǔn)備前處理1.2.1.1.藥品懸浮液少孢根霉在PDA平板上37℃培養(yǎng)3d;無菌水制成107cfu/mL的孢子懸浮液,用于接種。1.2.1.2毛紡1.2.2單因素前氧化實驗1.2.2.1.氧化ph的確定白坯分別以pH1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的乳酸酸化,以8%的孢子懸液接種,30℃培養(yǎng)60h。1.2.2.2.收養(yǎng)率的確定以上確定的pH,分別以6%、8%、10%、12%和14%的孢子懸液接種,30℃培養(yǎng)60h。1.2.2.3c溫度的確定1.2.2.4時間的確定以上各實驗條件均采用福林酚法測定蛋白酶活力為表證指標(biāo),并有3次重復(fù)。1.2.3最佳工藝條件的確定在單因素實驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)正交實驗中心組合實驗設(shè)計原理,進(jìn)行L9(34)正交實驗設(shè)計,實驗條件見表1,以蛋白酶活力為表征指標(biāo),3次重復(fù),確定前酵最佳工藝條件。1.2.4鹽膏的制備1.2.5發(fā)酵準(zhǔn)備1.2.5.染坯紅曲鹵的制備配料a:將1.5kg紅曲和0.6kg面糕曲用6.5kg黃酒浸泡2~3d,磨漿,加18kg黃酒攪勻,得染坯紅曲鹵。配料b:3kg紅曲和1.2kg面糕曲用12.5kg黃酒浸泡2~3d,磨漿,加63kg黃酒和15g糖精攪勻,得裝壇紅曲鹵。1.2.5.2安裝1.2.6全過程的質(zhì)量結(jié)構(gòu)和成熟階段的主要指標(biāo)的測定質(zhì)構(gòu):TPA下壓法;水分:恒重法;氯化鈉含量:硝酸銀滴定法;氨基酸態(tài)氮含量:甲醛滴定法。以上各實驗3次重復(fù)。2結(jié)果與分析2.1單因素前氧化實驗2.1.1初始ph對產(chǎn)品發(fā)酵的影響由圖1可知,隨酸化pH的升高,表征指標(biāo)先升后降。pH1.5~2.5時,攀升急劇,達(dá)最大值;而pH2.5到4.5時,逐漸下降?？梢妏H的高、低均影響菌種代謝及發(fā)酵腐乳的品質(zhì)。從表觀酸化pH指標(biāo)看,2.5時效果最佳,蛋白酶活力達(dá)23.69μg/mL。但此時腐乳白坯的實際pH應(yīng)是大于2.5的,這一點與孫興民等報道少孢根霉最適pH為3.0~4.5相符。所以該菌在此最適pH時生長最旺,發(fā)酵效果最佳,同時,也說明該菌在有雜菌的發(fā)酵條件下具有競爭優(yōu)勢,因而適于生產(chǎn)實際。故確定前酵pH2.5。2.1.2接種量指標(biāo)降低由圖2可知,不同接種量時,表征指標(biāo)為先升后降。接種量6%至10%時,指標(biāo)逐漸升高,在10%時達(dá)最高值21.22μg/mL;接種量10%~14%時,指標(biāo)逐漸走低。6%~10%的接種量,指標(biāo)升高,是因為生物群體只有在一定的數(shù)量水平時代謝活力旺盛,才能表現(xiàn)出更適應(yīng)環(huán)境的能力,符合微生物典型生長曲線理論中的接種量要求達(dá)到“一定量”的概念;而接種量10%~14%時,指標(biāo)不升反降,原因應(yīng)是同種菌種間營養(yǎng)競爭所致。所以在實際生產(chǎn)中,不同接種量同樣能達(dá)到最佳效果時應(yīng)遵循接種量少的原則,故確定接種量為10%。2.1.3反應(yīng)溫度對發(fā)酵的影響各溫度的表征指標(biāo)圖3所示。由本室以往研究及相關(guān)報道可知,少孢根霉屬于溫性真菌,最適溫度37℃,但本實驗數(shù)據(jù)卻以20℃為佳。分析認(rèn)為:在溫度較高或最適溫度時,菌株代謝快、代時短,菌種易老化。相反,生產(chǎn)實踐中的一些酶促反應(yīng)溫度往往在亞適溫度下、酶促反應(yīng)速率較緩時表現(xiàn)出最佳的發(fā)酵效果,即獲得性狀良好的產(chǎn)品。同時本實驗也再一次認(rèn)證了:在發(fā)酵實踐中,微生物最適生長溫度不一定是其產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的最適溫度的理念。為此,所試菌株發(fā)酵腐乳的前酵溫度為20℃。2.1.4發(fā)酵時間的影響在優(yōu)化了pH、接種量、溫度三個條件后又對該菌的前酵時間進(jìn)行探測,結(jié)果由圖4可知,表征指標(biāo)先升后降。12~36h指標(biāo)緩慢上升,36~48h升高明顯,說明發(fā)酵菌群體代謝活躍,是發(fā)酵的鼎盛時期;48h時,最大值為22.06μg/mL。從外觀形狀上看,48h的菌絲潔白致密,性狀良好。然而,時間在48~60h,不但表征指標(biāo)下降,毛坯表面也出現(xiàn)黑色孢子,性狀不佳,并伴有不良?xì)馕?對此認(rèn)為是酶系作用時間過長、分解過盛、坯體腐敗變質(zhì)所致。因此確定前酵時間48h。2.2蛋白酶活力用L9(34)正交表安排實驗,實驗結(jié)果見表2,方差分析見表3。根據(jù)表2極差R的大小得出:4個因素對蛋白酶活力影響為D>B>A>C,即接種量>時間>溫度>pH,由表3看出,因素接種量對蛋白酶活力影響顯著(p<0.05),由表2可知,因素pH對蛋白酶活力影響較小,故表3中未列出。理論最佳發(fā)酵條件A1B2C2D2,即發(fā)酵溫度20℃,時間48h,pH2.5,接種量10%,蛋白酶活力為22.06μg/mL。2.3發(fā)酵過程中的主要物質(zhì)結(jié)構(gòu)和成熟指標(biāo)的測定2.3.1后酵階段3g60d由圖5可知,腐乳發(fā)酵過程中,硬度先增后減。前酵階段,少孢根霉形成的菌絲將毛坯緊密包裹,硬度由白坯1199.9g升高至1203.6g;鹽制階段,食鹽進(jìn)入坯體,部分水分被析出,硬度增加顯著,鹽坯第7d時,硬度達(dá)到最大值為2535.5g;后酵階段中前40d,腐乳硬度迅速減小,40~60d變化不明顯,并在50d時變化趨于穩(wěn)定。后酵前40d的一段時間湯料不斷向坯體浸透,硬度迅速減小;到40d后坯體與湯料的鹽度接近,湯料向坯體滲透減少,故硬度變化不明顯,50d時硬度較白坯下降75.5%。2.3.2鹽制階段小體積彈性下降由圖6可知,發(fā)酵過程中,彈性逐漸減小。前酵階段,少孢根霉菌絲將毛坯緊密包裹,使坯體結(jié)構(gòu)致密,故彈性變化幅度較小,僅由白坯時0.89降至0.86;鹽制階段,彈性減小但不明顯,主要由于食鹽的加入使坯體硬度增加,導(dǎo)致彈性略降;后酵階段前40d,由于酶系的作用使大分子物質(zhì)逐漸降解為小分子,坯體逐漸疏松,彈性逐漸減小,40~60d時,酶系作用基本完全,故彈性變化不明顯,并在50d時趨于穩(wěn)定,此時彈性較白坯下降42.2%。2.3.3后酵50d的質(zhì)構(gòu)特性及乳酸成熟標(biāo)準(zhǔn)由圖7可知,發(fā)酵過程中,黏著性逐漸升高。前酵階段,少孢根霉分泌的酶系將部分大分子物質(zhì)分解成小分子,黏著性緩慢上升,由白坯的161.7J升高到165.2J;鹽制至后酵階段,酶系作用持續(xù)進(jìn)行,腐乳中蛋白質(zhì)逐漸至完全發(fā)生降解,黏著性持續(xù)上升,至后酵50d時黏著性較白坯升高42.5%。腐乳在后酵50d時質(zhì)構(gòu)變化趨于穩(wěn)定,酒精味道消失,質(zhì)地細(xì)膩,推測腐乳已成熟,此時測其氨基酸態(tài)氮、水分和氯化鈉含量分別為1.76g/100g、66.1%和8.9g/100g。據(jù)余若黔等報道氨基酸態(tài)氮含量≥1.5%時腐乳即成熟,并且根據(jù)國標(biāo):成熟的紅方腐乳水分含量≤72%,氯化鈉含量≥6.5g/100g,由以上可知,后酵50d達(dá)腐乳成熟標(biāo)準(zhǔn)。腐乳發(fā)酵過程中:一方面以蛋白酶活力為表征指標(biāo)優(yōu)化出前酵最佳工藝,在后酵過程中以蛋白酶為主的酶系分解坯體中的蛋白質(zhì)、脂肪等化學(xué)物質(zhì),從而使白坯向腐乳的轉(zhuǎn)變得以完成;另一方面從硬度、彈性較大的白坯到質(zhì)地細(xì)膩、入口無渣的腐乳,體現(xiàn)出發(fā)酵過程是理化性質(zhì)的變化引起質(zhì)構(gòu)的變化,而理化性質(zhì)的變化是以蛋白酶為主的酶系所決定的,可見整個實驗中各指標(biāo)間的變化相互影響、關(guān)系密切。3測定方法3.1少孢根霉GIM3.381發(fā)酵腐乳前酵最佳工藝:溫度20℃,時間48h,pH2.5,接種量10%,蛋白酶活力為22.10μg/mL。3.2腐乳發(fā)酵過程中,坯體的質(zhì)構(gòu)變化為:硬度先增后減、彈性逐漸降低、黏著性逐漸升高。3.3腐乳后酵50d成熟,此時硬度較白坯下降75.5%、彈性下降42.2%、黏著性升高42.5%;同時水分