藥物分析第4章 藥物的定量分析與分析方法的驗(yàn)證

第四章

藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證藥物分析教研室Contents定量分析樣品的前處理方法1定量分析方法的特點(diǎn)2藥物分析方法的驗(yàn)證3生物樣品分析方法的基本要求42一、概述定量分析方法選擇的依據(jù)：分析方法的特點(diǎn)；化學(xué)原料藥的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)；藥物制劑的處方組成。具有特征結(jié)構(gòu)的化學(xué)原料藥—容量、分光光度、色譜藥物制劑—處方中干擾組分的排除本節(jié)：含金屬或含鹵素、硫、磷、硒等特殊元素藥物有機(jī)鹵素藥物：指藥物結(jié)構(gòu)中所含鹵素直接與芳環(huán)或脂肪鏈相連者，而不包括某些藥物的鹵酸鹽或氫鹵酸鹽。含金屬的有機(jī)藥物及有機(jī)金屬藥物第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法Pretreatmentofsampleusedinquantitativeanalysis3第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法含鹵素藥物C—X乙烯型鹵和芳鹵烯丙型鹵和芐鹵鹵代烷型鹵素活潑性I＞Br＞Cl＞F分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù)越多，活潑性越強(qiáng)；同一碳上含多個(gè)鹵原子或一個(gè)苯環(huán)上含多個(gè)鹵原子時(shí)，活潑性增強(qiáng)更加明顯4三氯叔丁醇（防腐劑）六氯對(duì)二甲苯血防-846（廣譜抗寄生蟲(chóng)）泛影酸（造影劑）碘他拉酸（造影劑）第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法5第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法不經(jīng)有機(jī)破壞經(jīng)有機(jī)破壞直接測(cè)定配位滴定法氧化還原滴定法水解后測(cè)定堿水解：鹵素酸水解：金屬經(jīng)還原分解后測(cè)定：含碘有機(jī)藥物濕法破壞——?jiǎng)P氏定氮法干法破壞高溫灼燒法：含鹵素或磷、硒金屬氧瓶燃燒法6第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法(一)直接測(cè)定法葡萄糖酸鈣EDTA配位滴定富馬酸亞鐵鄰二氮菲-硫酸鈰滴定葡萄酸銻鈉間接碘量法適用范圍：金屬原子不直接與碳原子相連或某些C-M鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物。7第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法1、堿水解法三氯叔丁醇銀量法返滴定2、酸水解法適用范圍：含鹵素有機(jī)藥物結(jié)構(gòu)中鹵素原子結(jié)合不牢固的藥物。EDTA配位滴定(二)經(jīng)水解后測(cè)定法8第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法(三)經(jīng)還原分解后測(cè)定法適用范圍：碘原子直接與芳環(huán)連接的含碘有機(jī)化合物。9第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法三、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法

含氮、硫、硫柳汞、氯化鈉的生物制品、含氮有機(jī)合成藥物測(cè)定的前處理和生物制品中金屬元素測(cè)定時(shí)生物基質(zhì)的去除。

H2SO4-HNO3H2SO4-HClO4H2SO4-MSO4HNO3-KMnO4分解劑/消化劑輔助分解劑——?jiǎng)P氏定氮法測(cè)定含有氨基和酰胺結(jié)構(gòu)的藥物結(jié)構(gòu)(一)濕法破壞10第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法原理

將含氮藥物與硫酸在凱氏燒瓶中共熱，藥物分子中有機(jī)結(jié)構(gòu)被“消化”成CO2和H2O，有機(jī)結(jié)合的氮轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)氮，與過(guò)量的硫酸結(jié)合為硫酸氫銨和硫酸銨，經(jīng)堿化后釋放出氨氣，隨水蒸氣餾出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或堿滴定液滴定。

常量法——含氮量25～30mg

半微量法——含氮量

1.0～2.0mg11第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法凱氏燒瓶K2SO4(提高消解溫度)CuSO4(加快消解速度)硫酸堿液硼酸(吸收液)甲基紅-溴甲酚綠指示劑硫酸滴定空白校正12凱氏定氮反應(yīng)原理1.有機(jī)物中的氮在強(qiáng)熱和CuSO4，濃H2SO4作用下，消化生成(NH4)2SO4反應(yīng)式為：H2SO4==SO2+H2O+[O]R.CN.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O2NH3+H2SO4==(NH4)2SO42.在凱氏定氮器中與堿作用，通過(guò)蒸餾釋放出NH3，收集于H3BO3

溶液中反應(yīng)式為：2NH4++OH-==NH3+H2ONH3+H3BO3==NH4++H2BO3-3.再用已知濃度的H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)H2SO4

消耗的量計(jì)算出氮的含量

常量法：每1ml硫酸滴定液（0.05mol/L）相當(dāng)1.401mg的氮

半微量法：每1ml硫酸滴定液（0.005mol/L）相當(dāng)0.1401mg的氮4.蛋白質(zhì)含量計(jì)算：氮含量乘以相應(yīng)的換算因子(6.25)，既得蛋白質(zhì)的含量。反應(yīng)式為：H2BO3-+H+==H3BO313(二)干法破壞1.高溫灼燒法用于含鹵素、含磷藥物和藥物中砷鹽的檢查。常加入無(wú)水碳酸鈉、硝酸鎂、氫氧化鈣、氧化鋅等輔助灰化。2.氧瓶燃燒法第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法系指將含有待測(cè)元素的有機(jī)藥物置于充滿(mǎn)氧氣的密閉的密閉的燃燒瓶中充分燃燒，使有機(jī)結(jié)構(gòu)部分徹底分解為CO2和H2O，待測(cè)元素根據(jù)電負(fù)性的不同轉(zhuǎn)化為不同價(jià)態(tài)的氧化物，被吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐校俑鶕?jù)其性質(zhì)和存在方式選擇方法進(jìn)行分析。14第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法藥物產(chǎn)物吸收液測(cè)定方法含F(xiàn)HF水（F-）茜素氟蘭比色含ClHClNaOH溶液（Cl-）銀量法、汞量法含BrBr2、HBrNaOH溶液-SO2飽和溶液（Br-）含II2、HIO3、HIONaOH溶液-SO2飽和溶液（NaI）銀量法、汞量法NaOH溶液（NaIO3、NaI）Br-HAc溶液（HIO3）KI（I2）碘量法比色法含sSO3濃H2O2溶液（H2SO4）Ba沉淀（重量法）含PP2O5水（焦磷酸、偏磷酸）+硝酸→磷酸比色法（磷鉬藍(lán)）含SeSeO2、SeO3硝酸溶液→硒酸（H2SeO4）二氨基萘比色15第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法16氧瓶燃燒法注意事項(xiàng)：（1）燃燒瓶：大小適宜、干凈、有防爆措施（2）氧氣要充足：燃燒完全（不得有黑色炭化物）（3）產(chǎn)生煙霧應(yīng)完全被吸收：充分振搖煙霧顏色：碘，紫色；溴，紅棕色；氟氯,白色（4）測(cè)定氟化物：石英制燃燒瓶17第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法示例碘苯酯的含量測(cè)定

取本品約20mg，精密稱(chēng)定，照氧瓶燃燒法進(jìn)行有機(jī)破壞，用NaOHT.S.2ml與H2O10ml為吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液10ml，密塞，振搖放置數(shù)分鐘，加甲酸約1ml，用水洗滌瓶口，并通入空氣流約3~5min，以除去剩余的溴蒸氣，加KI2g，密塞，搖勻，用Na2S2O3液(0.02mol/L)滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml的硫代鈉液(0.02mol/L)相當(dāng)于1.388mg的C19H29IO2。18C19H29IO2分子量為416.34C19H29IO2——6Na2S2O3滴定度(T)=416.34×1/6×0.02=1.338(mg)第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法19第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)一、容量分析方法1.滴定度每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y(cè)藥物濃度。被測(cè)藥物滴定液20第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)直接滴定、生成物滴定剩余滴定21第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)示例一Vc的含量測(cè)定碘量法測(cè)定Vc含量[M(C6H6O6)=176.13]，C(I2)=0.05mol/L示例二

異煙肼的含量測(cè)定溴酸鉀法測(cè)定異煙肼含量[M(C6H7N3O)=137.14]，C溴酸鉀=0.01667mol/L22第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)示例三

葡萄糖酸銻鈉的含量測(cè)定0.3g供試品＋水100ml＋鹽酸15ml＋碘化鉀試液10ml密塞，振搖后暗處放置10min碘量法Sb5+——2S2O32-23示例四

司可巴比妥鈉的含量測(cè)定第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)取本品約0.1g，精密稱(chēng)定，置250ml碘瓶中，加水10ml，振搖使溶解，精密加溴滴定液(0.05mol/L)25ml，再加鹽酸5ml，立即密塞，并振搖1min，在暗處放置15min后，注意微開(kāi)瓶塞，加碘化鉀試液10ml，立即密塞，搖勻后，用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定，至終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定得的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。M=260.23司可巴比妥—溴=1:1W=0.1022g；F=1.038；V=15.73mlV0=23.2124第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)習(xí)題一剩余碘量法測(cè)定異煙肼含量

異煙肼在弱堿性溶液中，加定量過(guò)量的碘滴定液(0.1mol/L)氧化，反應(yīng)完成后，酸化，剩余碘滴定液用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定(以淀粉為指示劑)。25第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)習(xí)題二非那西丁含量測(cè)定精密稱(chēng)取本品0.3630g加稀鹽酸回流1小時(shí)后，放冷，用亞硝酸鈉液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00ml。每1ml亞硝酸鈉液（0.1mol/L）相當(dāng)于17.92mg的C10H13O2N，請(qǐng)計(jì)算非那西丁的含量。26第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)二、光譜分析法(一)紫外-可見(jiàn)分光光度法

儀器校正空白溶劑校正吸收峰波長(zhǎng)確定A－(0.3~0.7)27第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)含量測(cè)定方法1.對(duì)照品比較法原料藥固體制劑液體制劑282.吸收系數(shù)法習(xí)題一維生素B2含量測(cè)定取本品75mg，精密稱(chēng)定，置燒杯中，加冰醋酸1ml與水75ml，加熱溶解后，加水稀釋?zhuān)爬?，移?00ml量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻；精密量取10ml，置100ml量瓶中，加1.4%醋酸鈉溶液7ml，并用水稀釋至刻度，搖勻，照分光光度法在444nm的波長(zhǎng)處測(cè)吸收度，按維生素B2的吸收系數(shù)為323計(jì)算第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)29第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)3.計(jì)算分光光度法4.比色法30特點(diǎn)：靈敏度高，可達(dá)10-10～10-12g/ml要求低濃度下測(cè)定須做空白測(cè)定熒光弱的藥物可衍生化后測(cè)定第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)(二)熒光分析法31第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)三、色譜分析法（一）HPLC對(duì)儀器的一般要求和色譜條件色譜柱檢測(cè)器流動(dòng)相系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)理論塔板數(shù)分離度重復(fù)性拖尾因子32HPLC3.測(cè)定方法內(nèi)標(biāo)校正因子法

外標(biāo)法33示例一炔諾酮的含量測(cè)定照高效液相色譜法(附錄ⅤD測(cè)定)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(65:35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為244nm。理論塔板數(shù)按炔諾酮峰計(jì)算不低于1500，炔諾酮峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度及主成分峰后一雜質(zhì)峰與主成分峰的分離度均應(yīng)符合要求。內(nèi)標(biāo)溶液的制備取黃體酮約25mg，精密稱(chēng)定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。HPLC34HPLC測(cè)定法

取本品約25mg，精密稱(chēng)定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取此溶液2ml與內(nèi)標(biāo)溶液3ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜儀，記錄色譜圖；另取炔諾酮對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，同法測(cè)定。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。352.GC第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)示例松節(jié)油的含量測(cè)定

照氣相色譜法(附錄ⅥE測(cè)定)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用聚乙二醇(PEG)-20M為固定相，涂布密度為20%；柱溫為90℃。理論塔板數(shù)按α-蒎烯峰計(jì)算應(yīng)低于1500。校正因子測(cè)定取正丁醇適量，精密稱(chēng)定，加石油醚(30～60℃)制成每1ml含20mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取α-蒎烯對(duì)照品約30mg，精密稱(chēng)定，置10ml棕色量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2ml，加石油醚(30～60℃)至刻度，搖勻，吸取1μl注入氣相色譜儀，計(jì)算校正因子。36第二節(jié)定量分析方法的特點(diǎn)測(cè)定法

取本品約35mg，精密稱(chēng)定，置10ml棕色量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2ml，用石油醚(30～60℃)溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取1μl注入氣相色譜儀，測(cè)定，即得。本品含α-蒎烯(C10H16)不得少于70%。37第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則緩釋、控釋制劑指導(dǎo)原則微囊、微球與脂質(zhì)體制劑指導(dǎo)原則細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則目的：

證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測(cè)要求效能指標(biāo)：

評(píng)價(jià)分析方法的尺度

效能指標(biāo)包括:

精密度,準(zhǔn)確度,檢測(cè)限,定量限,選擇性,線(xiàn)性與范圍,耐用性38第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證一、準(zhǔn)確度（accuracy）

系指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度。(一)含量測(cè)定方法回收率(Recovery)回收試驗(yàn)加樣回收試驗(yàn)3×3，至少9個(gè)測(cè)定結(jié)果39第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證二、精密度(Precision)

系指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之接近的程度。表示：偏差(d)、標(biāo)準(zhǔn)偏差(s),、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)重復(fù)性:

同一實(shí)驗(yàn)室,同一人多次測(cè)定的精密度中間精密度:

同一實(shí)驗(yàn)室，不同人，不同儀器測(cè)定的精密度

重現(xiàn)性:

不同實(shí)驗(yàn)室，不同人測(cè)定的精密度40第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證三、專(zhuān)屬性(Specificity)

指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性。目視法信噪比法

S/N=3四、檢測(cè)限(LimitofDetection,LOD)藥物能被檢出的最低濃度(μg/ml)五、定量限(LimitofQuantitation,LOQ)藥物能被定量測(cè)定的最低濃度(μg/ml)信噪比法

S/N=1041第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證影響因素：被測(cè)溶液的穩(wěn)定性，流動(dòng)相的組成和pH，商品柱的品牌，柱溫等六、線(xiàn)性與范圍(LinearityAndRange)待測(cè)結(jié)果(響應(yīng)值)與試樣中被測(cè)物的濃度或量直接成正比關(guān)系的程度。

Y=a+bx（r=0.9999)七、耐用性(Robustness)測(cè)定條件稍有變動(dòng)時(shí)，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響程度42第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證①①已有重現(xiàn)性驗(yàn)證，不需驗(yàn)證中間精密度②如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補(bǔ)充②③視具體情況予以驗(yàn)證③43第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證各種含量測(cè)定方法對(duì)效能指標(biāo)的要求1.容量分析法

用原料藥精制品(含量>99.5%)或?qū)φ掌房疾旆椒ǖ木芏?，RSD≤

0.2%

；回收率一般在99.7～100.3%之間。

2.UV法

用適當(dāng)濃度的精制品進(jìn)行測(cè)定，其RSD≤1%

。制劑的測(cè)定，回收率一般應(yīng)在98～102％之間。3.HPLC法

要求RSD<2％，回收率98～102%之間。44第四節(jié)生物制品分析方法的基本要求一、常用樣品的種類(lèi)、采集和貯藏(一)血樣

①血漿(plasma)②血清(serum)③全血(二)唾液(三)尿液

用于藥物劑量回收、尿清除率、生物利用度，藥物代謝物及其代謝途徑、類(lèi)型、速率等的研究；臨床上用于判斷患者是否違反醫(yī)囑用藥。45第四節(jié)生物制品分析方法的基本要求二、生物樣品分析前處理技術(shù)全血/血漿，組織(1)蛋白沉淀(2)調(diào)節(jié)pH選擇性溶劑提取RIA殘?jiān)瘜W(xué)衍生化(提取烴基化)堿回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS46蛋白質(zhì)的去除加入與水混溶的有機(jī)溶劑(乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃)加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)加入強(qiáng)酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金屬沉淀劑(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)綴合物的水解酸水解(鹽酸)酶水