rp-hplc法測定木豆葉中球松素的含量

rp-hplc法測定木豆葉中球松素的含量

木豆葉，又名柳豆葉，來自科豆科植物cajanacanan（l.）milsp干燥葉?；粗参锬径乖谖覈Ｄ?、廣東、廣西、四川、云南、福建及臺灣等省區(qū)均有栽培,資源豐富。木豆葉有解痘毒、消炎腫之功效,現(xiàn)代藥理實驗與臨床研究提示該藥對骨及軟組織感染等疾病有顯著的療效,且使用安全。廣州中醫(yī)藥大學與浙江海正藥業(yè)在此基礎上將木豆葉開發(fā)成為治療股骨頭缺血性壞死的藥物“通絡生骨膠囊”,臨床治療股骨頭壞死安全有效。目前對木豆葉藥材的質(zhì)量研究尚欠缺。我們參照文獻報導從木豆葉藥材中分離得到異美五針松二氫黃酮(Pinostrobin,球松素)作為對照品,采用高效液相色譜法對不同木豆葉藥材樣品中的含量進行了分析。1儀器和試劑盒1.1儀器、試藥和儀器DIONEXSUMMIT高效液相色譜儀(P680HPLC四元梯度泵、STH585柱溫箱、PDA-100檢測器、ASI-100自動進樣器);Chromeleon色譜工作站;KQ3200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲儀;艾科浦U系列試驗室專用超純水機(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司);SartoriusCT225D電子分析天平。1.2木豆及球松素對照品木豆葉3批,批號:090811、090812、090813,購于廣州中醫(yī)藥大學大藥房,經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學蘇子仁研究員鑒定為豆科植物木豆Cajanuscajan(L.)Millsp.的干燥葉;球松素對照品,自制(純度≥99.0%,中國廣東分析測試中心測定);試劑:超純水、甲醇(色譜純、分析純),乙醇(分析純)。2方法和結果2.1流動相、柱溫色譜柱:PhenomenexlunaC18柱(250mm×4.60mm,5μm);流動相:甲醇-水,梯度洗脫,洗脫程序見表1;流速:1.0mL·min-1;柱溫:35℃;檢測波長為287nm。理論板數(shù)按球松素峰計算均不低于10000。在以上色譜條件下,木豆葉中的球松素與其他組分的色譜峰分離度良好。見圖1。2.2對照品儲備液精密稱取球松素對照品0.01081g,置10mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,得球松素對照品儲備液(1.081mg·mL-1)。分別精密吸取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.5mL球松素對照品儲備液至10mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,即得不同濃度的球松素對照品溶液(0.011mg·mL-1～0.162mg·mL-1)。2.3超聲處理法取木豆葉,粉碎,取約0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50mL,密塞,稱定重量,超聲處理30min(功率250W,頻率50kHz),放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,以0.45μm微孔濾膜濾過,即得。2.4標準曲線的繪制分別精密吸取不同濃度的球松素對照品溶液,進樣10μL,按上述色譜條件測定峰面積,并以濃度(mg·mL-1)為橫坐標,以峰面積為縱坐標進行線性回歸,得標準曲線。結果表明,球松素在0.011mg·mL-1～0.162mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好,回歸方程為Y=568.06X-0.76,r=0.9999。2.6進樣穩(wěn)定性測定取同一批木豆葉樣品(批號:090811)按供試品制備方法制成供試品溶液,分別于第0h、2h、4h、6h、12h、24h進樣10μL,按上述色譜條件進行測定,測得球松素的平均峰面積為15.705,RSD為1.41%,結果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.7重復性試驗取同一批木豆葉樣品(批號:090811),按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液,分別進樣10μL,按上述色譜條件進行測定,計算測得球松素的平均含量為2.613mg·g-1,RSD為1.49%,結果表明本方法重復性良好。2.8對照品溶液的制備取已知含量的木豆葉樣品(批號:090811),粉碎,取約0.25g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入球松素對照品儲備液(1.081mg·mL-1)0.3mL、0.5mL、0.8mL,按供試品制備方法制備。每一濃度平行操作3份,按上述色譜條件進行測定。測得球松素平均回收率為100.13%,RSD為1.01%,結果見表2。2.9樣品含量的測量3討論2.5主要提取溶劑及提取方法的選擇精密吸取濃度為0.043mg·mL-1的球松素對照品溶液10μL,按上述色譜條件進行測定,重復6次,測得球松素的平均峰面積為24.462,RSD為1.23%,說明本方法精密度良好。取3批木豆葉樣品,按供試品制備方法制備供試品溶液,分別進樣10μL,并按上述色譜條件進行測定,計算各批木豆葉中球松素的含量。結果見表3。3.1在提取溶劑的選擇上,分別考察了甲醇、75%乙醇、乙酸乙酯。結果發(fā)現(xiàn),使用甲醇作為提取溶劑能有效提取出木豆葉中的球松素,故選用甲醇作為提取溶劑。在提取方法的選擇上,考察了加熱回流及超聲處理,結果發(fā)現(xiàn)二者對球松素的提取效果沒有明顯差異?？紤]到超聲處理