耐鹽酵母對(duì)醬油風(fēng)味的影響

耐鹽酵母對(duì)醬油風(fēng)味的影響

柴油的味道是“色、香、味、體”的綜合體現(xiàn)，即汽油的顏色、香氣、味道和體。其中，香味是決定油田味道的重要因素。在醬油的高鹽稀態(tài)發(fā)酵過程中,一般都要添加耐鹽產(chǎn)香酵母,從而改善醬油的風(fēng)味提高醬油質(zhì)量。較常見的耐鹽產(chǎn)香酵母菌有S酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)、T酵母菌(Torulopsisversatilis)和C酵母菌(Candidaetchellsii)。目前醬油中已檢出的風(fēng)味成分近300種。醬油的風(fēng)味物質(zhì)按包含醇類、酯類、酸類、醛類及縮醛類、酚類、呋喃酮類和含硫化合物等。某些風(fēng)味成分形成途徑已被了解,還有一些風(fēng)味成分形成途徑尚待繼續(xù)研究。風(fēng)味成分的組成與原料品種、原料配比、菌種、生產(chǎn)工藝及技術(shù)管理等有關(guān)。了解醬油風(fēng)味物質(zhì)的種類及其產(chǎn)生的機(jī)制對(duì)于如何改造耐鹽酵母從而改善醬油風(fēng)味提高醬油質(zhì)量至關(guān)重要。1油食品的類型和形成機(jī)制1.1鹽水發(fā)酵過程中t酵母代謝產(chǎn)物的合成醬油風(fēng)味成分中含量最多的是醇類,并以乙醇為主。乙醇是由S酵母和糖類共同作用產(chǎn)生的,廣泛存在于整個(gè)發(fā)酵過程中。糖在S酵母的作用下形成乙醇,但是因?yàn)獒u油高鹽稀態(tài)發(fā)酵后期的鹽水發(fā)酵中鹽的濃度很高,導(dǎo)致由S酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的糖類物質(zhì)種類受到限制。在鹽水發(fā)酵過程中,S酵母只能利用葡萄糖卻不能利用麥芽糖。如果在無鹽的條件下,S酵母就能利用麥芽糖。與S酵母不同,在鹽水發(fā)酵過程中T酵母能夠利用麥芽糖。在乙醇發(fā)酵過程中最關(guān)鍵的酶是由ADH1基因編碼的乙醇脫氫酶。醬油中的高級(jí)醇主要有丙醇、丁醇、戊醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇等。S酵母和釀酒酵母醇類表現(xiàn)出相似的合成途徑。高級(jí)醇的產(chǎn)生直接與氨基酸代謝相關(guān),即氨基酸脫氨基、脫羧基后生成少一個(gè)碳原子的醇類。高級(jí)醇可以通過埃爾利希(Ehrlich)途徑由相關(guān)的支鏈氨基酸產(chǎn)生,這包括一個(gè)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的α-酮酸,一個(gè)去羧基反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的醛,然后醛發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生醇類。此外,α-酮酸作為關(guān)鍵的中間產(chǎn)物,也可在各自的氨基酸合成途徑中直接合成,并直接轉(zhuǎn)化成高級(jí)醇。在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中分別由BAT1和BAT2基因編碼的氨基轉(zhuǎn)移酶是催化支鏈氨基酸代謝的關(guān)鍵酶。當(dāng)然在S酵母中,高級(jí)醇類可能還存在其他的合成途徑。向S酵母中加入支鏈的氨基酸導(dǎo)致相應(yīng)的醇類產(chǎn)量增加。此外,醬油中的苯乙醇是具有玫瑰香氣的化合物,它是由T酵母在發(fā)酵過程中經(jīng)降解,再還原或經(jīng)碳水化合物代謝和氨基酸的生物合成過程這2種途徑而生成。1.2發(fā)酵時(shí)酯類物質(zhì)的變化酯類是構(gòu)成醬油風(fēng)味成分的主體,一個(gè)酸元和一個(gè)醇元即可生成酯。酯類作為基本的香味物質(zhì),可使麥芽酚、苯乙醇等關(guān)鍵風(fēng)味化合物的氣味更醇厚,緩沖醬油中鹽分的咸味。醬油中的酯類有多種,由于發(fā)酵過程中形成的酸類和醇類是多種多樣的,故生成的酯也是多種多樣的。目前,已經(jīng)確認(rèn)醬油中含乙酸乙酯和乳酸乙酯等45種酯類。醬油中高沸點(diǎn)酯類含量較多,而低沸點(diǎn)酯類含量則較少。由ATF1和ATF2基因編碼的乙醇?；D(zhuǎn)移酶催化的乙酰輔酶A和高級(jí)醇發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生揮發(fā)性酯類。除此外,由EHT1和EEB1基因編碼的其他酶類對(duì)乙酸乙酯的生成也很重要。1.3碳糖發(fā)酵生成乳酸和乙酸醬油風(fēng)味成分中的有機(jī)酸以乳酸和乙酸為主,乳酸菌利用葡萄糖進(jìn)行乳酸發(fā)酵生成乳酸,某些乳酸菌還可利用五碳糖(阿拉伯糖、木糖)發(fā)酵生成乳酸和乙酸。其中,乙酸是由乙醇氧化而成。除此之外,醬油中還含有檸檬酸、琥珀酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸等有機(jī)酸。醬油中的有機(jī)酸類互相起協(xié)同效應(yīng),豐富了醬油的風(fēng)味。它們和醬油中的醇類在貯存或烹調(diào)過程中起酯化反應(yīng),會(huì)提高醬油的酯香味,同時(shí)有機(jī)酸的酸味也可以緩和咸味。1.4醛的調(diào)劑作用醬油中的醛類物質(zhì)有甲醛、乙醛、丙醛、異丁醛、異戊醛、酚醛等。其中代表物質(zhì)是乙醛,呈辛辣刺激性氣味。醛除一部分由發(fā)酵產(chǎn)生的以外,大部分是由氨基酸脫胺、脫羰基生成。微量的醛在醬油香氣中起到調(diào)和作用。加熱醬油會(huì)提高其中乙醛和一些小分子醛類的濃度,而這些醛類化合物一般可與醇類、甲硫醇等發(fā)生縮合反應(yīng),產(chǎn)生與本身不同的香氣,使醬油風(fēng)味更復(fù)雜化。1.5乙基愈創(chuàng)苯酚醬油中的酚類物質(zhì)以揮發(fā)性酚為主體,特別是烷基苯酚,其是由來自小麥的原料經(jīng)米曲霉作用后再經(jīng)T酵母或C酵母發(fā)酵生成的。其代表性成分是4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG)和4-乙基愈創(chuàng)苯酚(4-EP)。其香氣特點(diǎn)十分明顯、活性強(qiáng),為醬油帶來類似丁香和煙熏的香味,是醬油的一種主要的香氣成分。4-EG是醬油風(fēng)味中有代表性的化合物之一,口感有發(fā)酵醬油特有的滋味,同時(shí)它還具有調(diào)節(jié)醬油中咸味的作用,增加了醬油的圓潤(rùn)感。醬油中含有1mgL~2mg/L的4-EG就可以明顯提高醬油的風(fēng)味。4-EG和4-EP分別來源于4-羧基-3-甲基肉桂酸和ρ-香豆酸。而4-羧基-3-甲基肉桂酸和ρ-香豆酸則來源于醬油生產(chǎn)中的麩皮中。這個(gè)轉(zhuǎn)變過程涉及到脫氨基作用,這也是S酵母無法作到的。1.6化合物類物質(zhì)及理化性質(zhì)除了上述特征風(fēng)味物質(zhì)外,醬油中還存在著如4-羥基-2(或5)乙基-5(或2)-甲基-3(2氫)-呋喃酮(HEMF)、4-羥基-2,5–二乙基-3(2氫)-呋喃酮(HDMF)、4-羥基-5甲基-3(2氫)-呋喃酮(HMMF)等呋喃酮類物質(zhì);2,3-二乙基-2-戊烯、苯乙烯等烯類物質(zhì);四氫化萘、甲基萘等萘類物質(zhì)以及部分有機(jī)酸鹽類。其中,HEMF是一種與醬油關(guān)系最密切的香氣成分,它具有小甜餅干那樣類似焦糖的香氣。在醬油中HEMF的含量越多越好,它能代表醬油的主體香氣。同時(shí),HEM具有抑制食道癌的作用。目前對(duì)HEMF形成機(jī)制的研究比較多。五磷酸循環(huán)對(duì)HEMF的形成至關(guān)重要。含有7個(gè)碳的HEMF是由含5個(gè)碳的氨基化合物與由葡萄糖代謝產(chǎn)生的含2個(gè)碳的化合物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的。HEMF形成的速率和數(shù)量受酵母菌種類、發(fā)酵液中葡萄糖和氯化鈉濃度的影響。2鹽酵母的改造由醬油風(fēng)味物質(zhì)的種類和形成機(jī)制可知,對(duì)耐鹽酵母進(jìn)行改造是改善醬油風(fēng)味的關(guān)鍵。對(duì)酵母菌株改造的遺傳操作策略主要包括隨機(jī)誘變、有性重組、代謝工程、進(jìn)化工程和基因組重排等。2.1可誘變的醬油品質(zhì)菌株的篩選利用誘變劑處理耐鹽酵母菌是改善醬油風(fēng)味的最經(jīng)典方法。常用的誘變劑有亞硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG)、甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulphonate,EMS)等。通過誘變的方法可以篩選得到醬油風(fēng)味明顯改善的菌株。如AOKIT等篩選得到的突變菌株產(chǎn)生的2–苯乙醇是野生型菌株的38倍。2.2菌株的雜交試驗(yàn)改造酵母菌的首要方法就是將不同基因背景的菌株進(jìn)行雜交。KIMJK將S酵母菌和T酵母菌進(jìn)行雜交得到的重組菌株使醬油的風(fēng)味得到了明顯改善,同時(shí)縮短了發(fā)酵周期。2.3代謝途徑修飾代謝工程是在對(duì)代謝流量及其控制進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行代謝途徑改造,以最大限度的提高目的代謝產(chǎn)物。從廣義上來講,利用分子生物學(xué)方法對(duì)某一代謝途徑進(jìn)行修飾也屬于代謝工程的范疇。目前,已經(jīng)構(gòu)建了多個(gè)S酵母/大腸桿菌的單拷貝和多拷貝的穿梭質(zhì)粒(如pZEU、pZEL和pZEA),其選擇標(biāo)記分別為ScURA3、ZrLEU2和ZrADE2。利用這些質(zhì)粒可以過量表達(dá)某一風(fēng)味物質(zhì)形成過程中的關(guān)鍵蛋白,從而改善醬油風(fēng)味,滿足人們對(duì)醬油不同風(fēng)味的需求。2.4altranscraptionmortgage模型進(jìn)化工程就是在達(dá)爾文進(jìn)化理論基礎(chǔ)上進(jìn)行隨機(jī)突變與選擇的一種技術(shù)方法,也稱為定向進(jìn)化。其中,整體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)工程(globaltranscriptionmachineryengineering,gTME)就屬于進(jìn)化工程的范疇。gTME是通過易錯(cuò)PCR突變來改變用于調(diào)解基因整體轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵蛋白,并因此使相關(guān)基因達(dá)到一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄水平。gTME已經(jīng)成功應(yīng)用到原核生物和釀酒酵母中。確定S酵母、T酵母和C酵母的全局轉(zhuǎn)錄因子序列是gTME策略能否改善醬油風(fēng)味的必要條件。2.5微生物群體重組承擔(dān)技術(shù)基因組重排就是在多個(gè)母本雜交基礎(chǔ)上把DNA改組與傳統(tǒng)的育種方法有機(jī)結(jié)合起來的技術(shù)方法。將經(jīng)典的育種和DNA改組相結(jié)合的基因組重排技術(shù)為快速的使微生物群體產(chǎn)生復(fù)雜后