基于熒光光譜成像技術的快速藻類鑒別研究

基于熒光光譜成像技術的快速藻類鑒別研究

藻類鑒別方法的應用近年來，由于污染，環(huán)境惡化，藻類污染的程度逐年加深。赤潮或水華在全球范圍內(nèi)頻繁出現(xiàn)是藻類污染程度加深的直接反映,其頻發(fā)對環(huán)境及生態(tài)資源會帶來極其嚴重的破壞?？焖?、實時地檢測水體中藻類的群落組成,不僅可以預防災害的發(fā)生,還可以掌握赤潮、水華災害的爆發(fā)機理。因此,發(fā)展快速、實時的藻類檢測技術對于預警及降低經(jīng)濟損失具有很重要的現(xiàn)實意義,成為了近年來研究的熱點。目前,常用的藻類鑒別方法主要有顯微鏡技術、圖像識別技術、色素分析技術、熒光分析技術等。顯微鏡技術主要以藻類的形貌特征為依據(jù),專業(yè)性要求高且易誤檢。圖像識別技術和色素分析技術因為操作條件和儀器的限制無法普及應用,熒光分析技術則丟掉了藻類的形貌信息。熒光光譜成像技術可以彌補這個不足之處。熒光光譜成像技術是一種將空間成像技術和光譜分析技術有機結(jié)合的新型分析檢測技術,它不僅能獲取豐富的圖像信息,同時還可以獲取樣本的空間信息和光譜數(shù)據(jù)。其原理是紫外光照射到被測物內(nèi)部時,會激發(fā)不同強度的熒光。激發(fā)的熒光波長與物質(zhì)內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)有關,且其熒光強度與物質(zhì)組份含量有關,物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、含量不同,發(fā)射熒光的波長和強度也就有所不同,從而可以快速有效地對不同物種進行鑒別。近年來,該技術已逐漸受生物醫(yī)學、精細農(nóng)業(yè)、食品科學、軍事等諸多學科領域的青睞。采用熒光光譜成像技術結(jié)合聚類分析及主成分分析方法,對八種常見藻類構(gòu)建模式識別模型,探索一種準確、快速、實時的藻類鑒別方法。1實驗部分1.1光譜成像系統(tǒng)采用暨南大學光電工程研究所設計研制的凝視型熒光光譜成像系統(tǒng)。系統(tǒng)主要器件包括:紫外光源、干涉濾光片、電可控液晶濾光器(LCTF)、鏡頭組、低照度面陣CMOS、圖像采集器、計算機等。1.2優(yōu)勢藻和水華藻采用的8個藻種(見表1)來自于暨南大學水生生物研究所,均為易引起赤潮、水華現(xiàn)象的優(yōu)勢藻種,發(fā)生赤潮、水華現(xiàn)象時肇事藻的優(yōu)勢度一般大于90%,甚至接近100%。隱藻置于BBM培養(yǎng)基中培養(yǎng),其余藻種于SE培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光照強度3000Lux,陰暗周期12∶12h,每個藻種平行培養(yǎng)5份。1.3檢測和成像設備對于藻類光譜圖像的采集在裝有空調(diào)的恒溫實驗室內(nèi)進行,為減少外界雜散光的干擾,裝置置于暗室中操作,8個藻種共取樣40份。利用光譜成像系統(tǒng)依次對40個樣本的藻液進行檢測。選取400~720nm的光譜區(qū)作為藻類鑒別的波長測量范圍,每隔5nm記錄一個點,實驗系統(tǒng)將接收的光信號轉(zhuǎn)換為電信號,經(jīng)過視頻采集卡保存于計算機中。這樣,一次檢測可以得到一個藻類樣本的光譜立方體,該光譜立方體由65幀256階灰度級的圖像組成。光譜成像系統(tǒng)拍攝得到的光譜圖像不僅包含了藻類樣本的內(nèi)部物理結(jié)構(gòu)、化學成分和形貌信息,而且還包含了背景、噪音及其他干擾的信息。這些干擾信息會使得光譜成像圖信息復雜化,在有些情況下甚至會湮沒待測物質(zhì)的信息。所以在拍攝過程中為消除不可避免的噪聲、減少外界因素帶來的影響并簡化數(shù)據(jù)處理的運算過程,需對拍攝到的圖片進行去噪、二值化處理,確定有效像素后進行統(tǒng)計平均,從而獲得光譜-光強曲線。1.4類間對象的同質(zhì)性和異質(zhì)性的最大化聚類分析主要將個體或?qū)ο蠓诸?使得同一類中的對象之間的相似性比與其他類的對象的相似性更強。目的在于使類間對象的同質(zhì)性最大化和類間對象的異質(zhì)性最大化。采用MATLABR2012b軟件對得到的光譜數(shù)據(jù)進行聚類分析。采用歐氏距離法計算樣本間的聚類距離,應用平均加權方法計算系統(tǒng)聚類樹,把一些相似程度較大的樣本聚合為一類,把另外一些彼此之間相似程度較大的樣本又聚合為另一類,直到把所有的樣本聚合完畢。1.5設計一:將大量自變量納入擬合的目主成分分析方法是一種重要的多元統(tǒng)計分析方法,它主要利用降維的思想,排除眾多化學信息中相互重疊的部分。利用方差最大原則,對樣本的原始光譜數(shù)據(jù)中所包含的多個自變量進行線性擬合,將所得的新的低維變量代替原始的高維變量,從而達到數(shù)據(jù)降維的目的。在實際應用過程中,通常選取前幾個對偏差量貢獻較大的主成分,這樣既能使信息損失不太多,又能達到減少變量、簡化問題的目的,一般推薦累計貢獻率達到80%以上為宜。本研究采用SPSS20.0軟件,對樣本的光譜數(shù)據(jù)進行處理。2結(jié)果與討論2.1熒光發(fā)射峰特征每個樣本經(jīng)光譜成像系統(tǒng)處理后得到一個光譜立方體,圖1為四尾柵藻樣品在測量峰值為695nm時的熒光圖,圖2為處理過的二值圖像。根據(jù)光譜立方體繪制每個樣本的光譜曲線,見圖3。由圖可知,在400~620nm波長范圍內(nèi)40個樣本的光譜曲線基本相似,在620~720nm波長范圍內(nèi)這八種藻類的光譜曲線差異顯著,其中,衣藻、鐮形纖維藻、四尾柵藻和隱藻的光譜曲線雖較為相似,但熒光強度峰值各不相同,四尾柵藻的峰值最高,而隱藻的光譜曲線走勢較為平緩。這是由于引起赤潮或水華現(xiàn)象的優(yōu)勢藻種對光譜數(shù)據(jù)的作用主要體現(xiàn)在藻類所含的葉綠素上,不同藻類葉綠素的種類和濃度不同,則熒光發(fā)射峰也會隨之變化。朱明遠指出葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c的熒光發(fā)射峰分別為670,655,640nm。一般情況下,不同藻類細胞含有的葉綠素種類和濃度均有所差異,因此,經(jīng)紫外光源激發(fā)的光譜也就有所差異。2.2藻類種類及大小正確率利用Matlab軟件將40個樣本的光譜數(shù)據(jù)聚類,得到如圖4的樹狀聚類圖,其橫坐標表示樣本編號,縱坐標表示樣本間的歐式距離。由圖4可知,40個藻類樣本在歐式距離L=2.452以上水平上被分為8類,其中1~5號為鐮形纖維藻,6~10號為隱藻,11~15號為枝鞘藻,16~20號為四尾柵藻,21~25號為湖絲藻,26~30號為小球藻,31~35號為滿江紅魚腥藻,36~40號為衣藻,分類正確率為100%。由以上結(jié)果可知,光譜數(shù)據(jù)經(jīng)聚類分析后所得結(jié)果較好,在L=2.452以上水平處可將樣本正確鑒別,能有效區(qū)分各種藻類樣本。2.3光譜聚類分析在400~720nm波段區(qū)間對40種樣本的原始光譜數(shù)據(jù)采用主成分分析方法進行處理,前4個主成分的累積貢獻率如表2所示。根據(jù)表2可知,前2個主成分的累計貢獻率已超過90%,所以僅用前2個主成分就可以表示原始光譜的主要信息。圖5是40個樣本的第1和第2主成分的得分圖。圖中橫坐標表示第1主成分的得分值,縱坐標表示第2主成分的得分值。從圖5可看出,不同藻種大致分布于不同區(qū)域,四尾柵藻、湖絲藻、枝鞘藻等可以獨立分別,具有較好的鑒別性。但鐮形纖維藻和衣藻分布較為接近,無法明顯區(qū)分。由于采集到的光譜可能會受到樣品不均勻、光散射等因素的影響,為消除這些影響成分,對數(shù)據(jù)采用一階微分、二階微分、多元散射校MSC以及變量標準化SNV等預處理方法后進行主成分分析,見圖6—圖9所示。采用一階微分、多元散射校正MSC以及變量標準化SNV預處理的光譜數(shù)據(jù)的主成分得分圖聚類的效果并不理想,而且樣本分布較為離散,不同藻種樣本之間交叉重疊明顯。采用二階微分預處理的光譜數(shù)據(jù)的主成分得分圖聚類的效果較為理想,而且不同藻種樣本獨立分布。因此,以二階微分預處理的光譜為基礎,經(jīng)過主成分分析進行降維,對于八種藻類具有較強的區(qū)分能力。由此可見,運用主成分分析方法對藻類的鑒別效果理想。3光譜數(shù)據(jù)處理利用熒光光譜成像分析技術對八種藻類樣本進行鑒別分析,結(jié)果表明采用系統(tǒng)聚類分析進行建模,藻類樣本的識別正確率均可達100%。對光譜數(shù)據(jù)進行二