一種微型角毛藻的分離鑒定

一種微型角毛藻的分離鑒定

1浮游植物的種類(lèi)、生物學(xué)和浮游學(xué)小型浮游植物（粒度為2.20m）是海洋環(huán)境上的主要初級(jí)生產(chǎn)者，占海洋初始工業(yè)的很大一部分。特別是在盲水域，小型浮游植物可占初始工業(yè)的80%以上，顆粒層結(jié)構(gòu)上的小型浮游植物對(duì)初始工業(yè)的貢獻(xiàn)相對(duì)較大。角毛藻屬于硅藻門(mén)(Bacillariophyta)、中心綱(Centriae)、盒形藻目(Biddulphiales)、角毛藻科(Chaetoceroceae)、角毛藻屬(Chaetoceros)。培養(yǎng)種類(lèi)有牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、鈣質(zhì)角毛藻[Chaetoceroscalcitrans(Paulsen)Takana]、纖細(xì)角毛藻(Chaetocerosgracilis)等,它們都是生長(zhǎng)在海中的浮游微藻,細(xì)胞小,細(xì)胞壁薄,大多數(shù)是單個(gè)細(xì)胞,也有數(shù)個(gè)細(xì)胞集成群體的。殼面呈橢圓形或圓形,中間略突起,少數(shù)較平坦。殼環(huán)面呈長(zhǎng)方形至四角形。殼環(huán)帶不明顯,角毛細(xì)而長(zhǎng),末端尖。培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)常有變化,細(xì)胞中間膨大,角毛縮短或消失,繁殖方式一般為無(wú)性的二分裂繁殖。環(huán)境不良時(shí)可形成休眠孢子。角毛藻屬耐高溫種類(lèi),適合在夏季培養(yǎng),是雙殼貝類(lèi),海參,海膽甲殼類(lèi)等幼體的優(yōu)質(zhì)餌料,角毛藻作為一種經(jīng)濟(jì)藻類(lèi)有十分廣闊的前景。微型角毛藻是指粒徑為2~20μm的角毛藻屬的藻類(lèi),目前對(duì)其系統(tǒng)的研究較少,研究較多的主要是作為餌料的種類(lèi),如牟氏角毛藻和纖細(xì)角毛藻,它們是對(duì)蝦、海膽、海參等養(yǎng)殖品種的優(yōu)質(zhì)餌料。以前對(duì)浮游植物的分類(lèi)學(xué)研究主要依靠形態(tài)學(xué)手段,但形態(tài)學(xué)的鑒定有諸多不足之處。首先,形態(tài)學(xué)的鑒定需要有經(jīng)驗(yàn)豐富的專(zhuān)業(yè)工作人員,而且工作量大;其次,生物的形態(tài)學(xué)特征有時(shí)會(huì)因環(huán)境的變化而改變,形態(tài)學(xué)鑒定無(wú)法解決這一難題。分子生物學(xué)分類(lèi)方法以核酸序列的差異為分類(lèi)依據(jù),由于核酸序列在遺傳上的穩(wěn)定性要大大高于形態(tài)學(xué)特征,避免了環(huán)境因素造成的細(xì)微外觀差異引起的錯(cuò)誤判斷,解決了依賴主觀判斷而存在的困擾,因而在近年來(lái)得到了廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)從天然海水中分離到一種微型硅藻,借助光鏡和電鏡技術(shù),初步判斷為角毛藻,進(jìn)一步利用5.8SrDNA-ITS和18SrDNA序列的擴(kuò)增和分析,對(duì)這株藻進(jìn)行了分類(lèi)鑒定。2實(shí)驗(yàn)材料和方法2.1材料表面2.1.1有限稀釋法本實(shí)驗(yàn)所用藻株C.sp.qd分離于青島太平角海域(36°02′N(xiāo),120°20′E)。分離方法為96孔板有限稀釋法。藻株培養(yǎng)于不加硅的F/2培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度為24℃,明暗時(shí)間比為12h∶12h,光照度為1300lx。2.1.2dnapurificicici本體系統(tǒng)和試劑凝膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAPurificationKit)購(gòu)自TakaRa公司,Taq酶等PCR試劑購(gòu)自MBI公司,其他試劑為分析純。2.2方法2.2.1微生物濾膜富集使用96孔板分離培養(yǎng)的方法,從天然海水中純化微藻,利用500目篩絹和0.8μm微孔濾膜富集細(xì)胞大小為1~20μm的微藻,并在微藻放入f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)至適宜濃度。血球計(jì)數(shù)板計(jì)算密度,根據(jù)密度將藻液稀釋到每200μL含有1~2個(gè)單藻,并把它們分到96孔板中,定期鏡檢,直到100倍油鏡下觀察藻細(xì)胞形態(tài)一致即純化成功。2.2.2有明膠膜的制備用1.5mLEP管取1mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞,按1000r/min離心10min收集藻體,加1ml1%戊二醛固定2~3h,按1000r/m離心10min,用0.1mol/dm3的磷酸緩沖液漂洗3次,然后依次用30%,50%,70%,90%,100%的乙醇進(jìn)行逐級(jí)脫水,用吸管將含有樣品的乙醇溶液滴在有明膠膜的蓋玻片上,可防止細(xì)胞被沖走,用臨界點(diǎn)干燥法干燥,用離子濺射鍍膜法鍍膜。2.2.3藻體水分含量測(cè)定用1.5mLEP管取1mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞,按1000r/min離心收集藻體,加500μL濃鹽酸,水浴煮沸20~30min,加高錳酸鉀溶液少許,靜置24h,加草酸褪色,水洗至中性,用銅網(wǎng)直接蘸取少許樣品,靜置片刻,用吸水紙吸去多余的水分,干燥后觀察。1.2.4藻細(xì)胞研磨液取角毛藻對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞3×106個(gè)/mL,5000r/min離心5min,收集藻細(xì)胞。將藻細(xì)胞于液氮中研磨后轉(zhuǎn)入1.5mL離心管。使用TIANGEN植物總DNA試劑盒(TIANGENBiotechBeijing)提取基因組DNA,操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2.2.5pcr擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中硅藻18S序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增18S序列;根據(jù)已測(cè)序的18S序列設(shè)計(jì)ITS-5.8SrDNA的正向引物,根據(jù)相關(guān)硅藻的ITS序列設(shè)計(jì)反向引物。PCR擴(kuò)增包含5.8SrDNA在內(nèi)的ITS1和ITS2片段、18SrDNA末端保守序列和28SrDNA前端保守序列,由上海博尚公司合成。實(shí)驗(yàn)所涉及引物見(jiàn)表1。2.2.6外循環(huán)PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增結(jié)果用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)。2.2.7質(zhì)粒載體pmd18-t將PCR產(chǎn)物用TaKaRa凝膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAPurificationKit)回收后再用T4DNA連接酶將目標(biāo)片段連接到質(zhì)粒載體PMD18-T上,轉(zhuǎn)入細(xì)菌DH5α,由北京華大生物公司測(cè)序。2.2.8角毛藻遺傳分析結(jié)果在NCBI服務(wù)器上用NucleotideBlast進(jìn)行同源檢測(cè),證實(shí)所得的序列為ITS1,ITS2,5.8SrDNA以及部分18SrDNA,28SrDNA區(qū)域。將測(cè)得的序列和其他角毛藻5.8SrDNA-ITS序列(來(lái)自GenBank)用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行序列對(duì)齊排序、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、遺傳距離值計(jì)算分析。用ClustalX1.83進(jìn)行多序列對(duì)位分析。采用MEGA3.1分別采用NJ法、ME法和UPGMA法建樹(shù),用Kimura2-parameter計(jì)算遺傳距離值,重復(fù)1000次計(jì)算bootstrap值。3結(jié)果與討論3.1角毛藻屬的藻類(lèi)從100倍油鏡下可看到此藻細(xì)胞體呈正方形(見(jiàn)圖1a),細(xì)胞長(zhǎng)(7.78±1.99)μm,寬(5.44±1.67)μm,在細(xì)胞體四角各有一角毛,角毛長(zhǎng)度為(16.11±2.42)μm。具有多個(gè)貼壁的色素體。細(xì)胞獨(dú)立生活,不連成群體。在光鏡下偶可觀察到脫殼的細(xì)胞體及細(xì)胞殼(見(jiàn)圖1b),透明狀的為脫下的細(xì)胞殼,還帶有角毛結(jié)構(gòu),陀螺狀的為脫殼后的藻細(xì)胞,已看不到角毛結(jié)構(gòu)。此細(xì)胞可能為環(huán)境不良時(shí)形成的休眠孢子。在掃描電鏡下觀察到較完整的細(xì)胞(見(jiàn)圖1c),細(xì)胞呈圓柱形,環(huán)面觀近似正方形,細(xì)胞表面光滑,殼面觀呈橢圓形,殼面兩端邊緣各有兩條角毛,角毛基部隆起。還觀察到脫殼的細(xì)胞體,呈近似陀螺狀,形狀與在光鏡下看到的相符(見(jiàn)圖1d)。細(xì)胞中部有一環(huán)狀突起,細(xì)胞上部呈橢球形,下部呈陀螺狀。也可觀察到脫下的細(xì)胞殼(見(jiàn)圖1e),可見(jiàn)細(xì)胞壁較薄,細(xì)胞內(nèi)容物已消失。圖1f為透射電鏡下觀察到得較完整的細(xì)胞,可見(jiàn)致密的細(xì)胞體。由于透射電鏡處理方法要用到濃鹽酸,離心后細(xì)胞基本已破碎,很難觀察到完整的細(xì)胞,由圖可看到細(xì)胞體并無(wú)明顯骨架結(jié)構(gòu)。角毛呈網(wǎng)狀的硅質(zhì)骨架結(jié)構(gòu),基部較中部致密(見(jiàn)圖1j)。每隔0.5μm左右有一互生的刺狀突起,頂端呈錐狀(見(jiàn)圖1g,i)。頂部放大觀察可分辨出網(wǎng)狀骨架主干呈螺旋狀,延伸至頂端(如圖1i)。從以上光鏡照片和電鏡照片可初步推斷此藻株為角毛藻屬的藻類(lèi)。根據(jù)形態(tài)特征初步將這株藻命名為Chaetoceros.sp.qd。3.21c.sp.qd的檢測(cè)對(duì)角毛藻的基因組DNA使用自行設(shè)計(jì)的硅藻門(mén)的18SrDNA特異性引物,經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到的目的片段,經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖電泳分析,DNA片段為1700bp左右。由測(cè)序結(jié)果得知C.sp.qd的18S序列部分長(zhǎng)度為1623bp。GC含量為46.58%,使用NucleotideBlast將所測(cè)序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析,得到C.sp.qd與ChaetocerosgracilisstrainUTEXLB2375的18SrDNA相似值最高,達(dá)到99%。3.3c.sp.qd的5.8srdna-同源性比對(duì)對(duì)角毛藻的基因組DNA使用角毛藻屬的5.8SrDNA-ITS區(qū)的特異引物,經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到的目的片段,經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖電泳分析,DNA片段為1100bp左右。5.8SrDNA-ITS測(cè)序后,C.sp.qd的ITS的序列長(zhǎng)度為1083bp。去掉部分18SrDNA和28SrDNA序列,5.8SrDNA-ITS的序列總長(zhǎng)度為837bp。將C.sp.qd的5.8SrDNA-ITS序列與從Genbank獲取的所有相關(guān)角毛藻的5.8SrDNA-ITS序列進(jìn)行比較(表2)?？梢园l(fā)現(xiàn)角毛藻屬的不同種在5.8SrDNA-ITS的總長(zhǎng)度、5.8S長(zhǎng)度、ITS1,ITS2長(zhǎng)度等在基本性狀上都有差異。5.8SrDNA-ITS的總長(zhǎng)度變化是698~810bp,而本藻種5.8SrDNA-ITS區(qū)比已知角毛藻屬的種類(lèi)更長(zhǎng),達(dá)到837bp。5.8S區(qū)域的長(zhǎng)度是157~160bp,ITS1區(qū)域的長(zhǎng)度是281~331bp,ITS2區(qū)域的長(zhǎng)度是260~324bp,其中本種與已知角毛藻屬物種在ITS2區(qū)的長(zhǎng)度差別最大,比角毛藻屬的其他種類(lèi)最長(zhǎng)的ITS2區(qū)還長(zhǎng)36bp,這顯示此種與已知角毛屬其他種類(lèi)有較大差異。2.4種方法所建的進(jìn)化樹(shù)的親緣關(guān)系利用表2所列出的13株角毛藻5.8SrDNA-ITS序列,以CetrariaodontellacountryFinland(AF228304)5.8SrDNA-ITS序列為外群,用MEGA3.1軟件按照三種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),分別為NJ法(見(jiàn)圖2),ME法和UPGMA法,用三種方法所建的進(jìn)化樹(shù)樹(shù)形幾乎完全相同,而且在每個(gè)主要節(jié)點(diǎn)都有很高的支持率。用三種方法所建的進(jìn)化樹(shù)中C.sp.qd都不與所有已知的角毛藻屬的種類(lèi)聚群,并且在較早的進(jìn)化階段就獨(dú)立分支,節(jié)點(diǎn)支持率分別為86(NJ樹(shù))、79(ME樹(shù))、99(UPGMA樹(shù)),支持率都很高。為進(jìn)一步分析此種與其他屬內(nèi)角毛藻種的親緣關(guān)系,將所有角毛藻序列和外群藻種使用MEGA3.1計(jì)算它們之間的遺傳距離值。從表3可以看出C.sp.qd與已知序列的12種角毛藻的遺傳距離為0.315~0.483,與已知角毛藻屬的種類(lèi)遺傳距離較大,而所有已知序列的12種角毛藻屬內(nèi)不同種間的遺傳距離為0.007~0.476。角毛藻屬和同是盒形藻科不同屬的齒狀藻屬之間的遺傳距離值為0.703~0.783。4討論4.1細(xì)胞培養(yǎng)藻breatocarlo從形態(tài)學(xué)上觀察,此藻種為單細(xì)胞生長(zhǎng),并不像一般的角毛藻那樣連成長(zhǎng)鏈,如扭鏈角毛藻(Chaetocerostortissimus)、遠(yuǎn)距角毛藻(Chaetocerosdistans)、短孢角毛藻(Chaetocerosbrevis)等。細(xì)胞較小,只有5~7μm,根據(jù)Rogerson等對(duì)纖細(xì)角毛藻(Chaetocerosgracilis)的研究,此藻種與纖細(xì)角毛藻外形相近,光鏡下無(wú)法區(qū)分。Rogerson等對(duì)纖細(xì)角毛藻的角毛結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,其中螺旋狀的硅質(zhì)骨架和互生的小刺與C.sp.qd相似,但螺旋和小刺的形狀與本種也有差別,從照片可清楚地看到本種螺旋狀的骨架,骨架之間有橫隔相連,形成小孔結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1),從纖細(xì)角毛藻的照片可看到小孔結(jié)構(gòu)呈螺旋狀排列,并沒(méi)有觀察到骨架結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1h),本種的小刺形狀短而鈍,而纖細(xì)角毛藻的尖而長(zhǎng),呈三角形(見(jiàn)圖1g,h)。此外由于文中沒(méi)有對(duì)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行描述,無(wú)法進(jìn)行比較,因此無(wú)法確定C.sp.qd是否是纖細(xì)角毛藻。4.2sahs-sarst將C.sp.qd的5.8SrDNA-ITS序列與從Genbank獲取的所有相關(guān)角毛藻的5.8SrDNA-ITS序列進(jìn)行比較(見(jiàn)表2),可以發(fā)現(xiàn)角毛藻屬的不同種在5.8SrDNA-ITS的總長(zhǎng)度、5.8S的長(zhǎng)度、ITS1,ITS2的長(zhǎng)度等基本性狀上都存在差異。5.8SrDNA-ITS的總長(zhǎng)度是698~810bp,而本藻種5.8SrDNA-ITS區(qū)比已知角毛藻屬的種類(lèi)更長(zhǎng),達(dá)837bp。5.8S區(qū)域的長(zhǎng)度是157~160bp,ITS1區(qū)域的長(zhǎng)度是281~331bp,ITS2區(qū)域的長(zhǎng)度是260~324bp,其中C.sp.qd與已知角毛藻種在ITS2區(qū)差別最大,比所有角毛藻屬內(nèi)其他種類(lèi)最長(zhǎng)的ITS2區(qū)還長(zhǎng)36bp。這顯示此種與角毛藻屬內(nèi)其他種類(lèi)有較大差異,并且本種與纖細(xì)角毛藻在ITS區(qū)的差別也比較大(見(jiàn)表2),總長(zhǎng)度比Chaetocerosgracilis長(zhǎng)46bp,比ChaetocerosgracilisstrainUTEXLB2375和ChaetocerosgracilisstrainUTEXLB2658長(zhǎng)27bp,特別在ITS2區(qū),比Chaetocerosgracilis長(zhǎng)36bp,比ChaetocerosgracilisstrainUTEXLB2375和ChaetocerosgracilisstrainUTEXLB2658長(zhǎng)41bp。通過(guò)BLAST比對(duì)可知,與本種最接近的是Chaetocerosgracilis,相似度達(dá)到99%,但覆蓋度僅為59%,主要位于5.8S區(qū),在ITS區(qū)相似度不高,證明與纖細(xì)角毛藻差別較大。ITS區(qū)長(zhǎng)度和比對(duì)結(jié)果表明此種可能是一新的角毛藻屬物種。通過(guò)三種方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,分析得出的結(jié)果一致,均顯示C.sp.qd比較特殊,不與已知的角毛藻聚群,在進(jìn)化的早期就已經(jīng)獨(dú)立分支,并且分支節(jié)點(diǎn)的支持率都很高,此結(jié)果也支持此藻種為角毛藻屬內(nèi)一新種。進(jìn)一步分析遺傳距離分析可知角毛藻屬內(nèi)種間的遺傳距離為0.007~0.476,角毛藻屬與同屬盒形