慶大霉素抗體在疫苗研制中的殘留分析

慶大霉素抗體在疫苗研制中的殘留分析

在疫苗的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，需要添加過(guò)量的抗生素，如清霉素和卡拉霉，以抑制污染細(xì)菌的生長(zhǎng)。如果帶入到成品疫苗中抗生素殘留量過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致人的機(jī)體產(chǎn)生異常反應(yīng),如皮膚潮紅、發(fā)癢、心悸、皮疹、呼吸困難,嚴(yán)重者可出現(xiàn)休克或死亡,因此應(yīng)嚴(yán)格控制疫苗中抗生素的殘留。在研制過(guò)程中即使通過(guò)換洗、純化以及最終超濾等工藝,也很難將抗生素全部清除干凈。文章分別選擇了研制疫苗4個(gè)生產(chǎn)階段(原液階段、純化前階段、純化后階段以及成品階段)樣品作為樣本,通過(guò)抗生素殘留測(cè)定,考察疫苗研制的各階段抗生素的殘留和去除。1材料和方法1.1慶大霉素的殘留采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中殘留的慶大霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗慶大霉素抗體,加入酶標(biāo)二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與殘留物慶大霉素的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出該樣本中慶大霉素的殘留量。1.2試驗(yàn)樣本研制的疫苗原液、160×濃縮液、半成品、成品,均由成都生物制品研究所提供。1.3聚苯乙烯離心管XXXXXX公司微孔板酶標(biāo)儀型號(hào):XXXXXXXX;2ml聚苯乙烯離心管;微量移液器:單道20～200ml、200～1000ml、多道250ml。1.4標(biāo)準(zhǔn)液的制備1.4.196孔酶標(biāo)板×1塊(包被有偶聯(lián)抗原)1.4.2高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(1ml/瓶)1mg/ml及標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶(1ml/瓶):0ng/ml,0.1ng/ml,0.3ng/ml,0.9ng/ml,2.7ng/ml,8.1ng/ml。1.4.3酶標(biāo)二抗12ml,抗體工作液7ml,底物液A液7ml,底物液B液7ml,終止液7ml,20×濃縮洗滌液40ml,2×樣本稀釋液50ml,去離子水。1.5測(cè)試方法1.5.1制備將2×樣本稀釋液按1:1稀釋即為1×樣本稀釋液,備用;然后將待測(cè)樣品用1×樣本稀釋液稀釋至10倍,即慶大霉素含量為0.1～8.1ng/ml范圍內(nèi),取50ml用于分析。1.5.2編號(hào)指示將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。1.5.3抗體反應(yīng)加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對(duì)應(yīng)的微孔中,再加入抗體工作液50μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。1.5.4吸水紙拍干液小心揭開(kāi)蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液(見(jiàn)配液1)250ml/孔,充分洗滌4～5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)。1.5.5酶標(biāo)二醇添加加入酶標(biāo)二抗100μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min,取出重復(fù)洗板步驟4.4。1.5.6顯色加入底物液A液50μl/孔,再加底物液B液50μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中避光反應(yīng)15min。1.5.72結(jié)果2.1百分吸光度值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100,即:百分吸光度值(%)=B/B0×100。B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值2.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,r2≥0.98,見(jiàn)圖1、表1。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實(shí)際殘留量(表2)。3討論3.1純化工藝對(duì)慶大霉素的殘留量的影響通過(guò)對(duì)疫苗樣本中的慶大霉素殘留量的檢測(cè),不難發(fā)現(xiàn),在疫苗的生產(chǎn)初期的原液及160×濃縮液,慶大霉素的殘留量較高,分別達(dá)到20.4ng/ml及30.6ng/ml,經(jīng)過(guò)純化精制后,其殘留量明顯下降近兩個(gè)數(shù)量級(jí),分別達(dá)到0.38ng/ml及0.61ng/ml,可見(jiàn)通過(guò)純化工藝,可以大幅度降低疫苗中慶大霉素的殘留量。3.2減少抗生素的使用抗生素類藥物在治療感染性疾病方面發(fā)揮了重大的作用,但抗生素濫用會(huì)造成嚴(yán)重的不良后果。美國(guó)、歐盟和中國(guó)等都制定了食品中抗生素的最大殘留限量指標(biāo),以限制食品中抗生素的殘留量。我國(guó)在2010版《中國(guó)藥典》中增加相關(guān)內(nèi)容,嚴(yán)格控制生物制品生產(chǎn)過(guò)程中抗生素的使用。生產(chǎn)過(guò)程中,應(yīng)盡可能避免使用抗生素,必須使用時(shí),應(yīng)選擇安全性風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低的抗生素,使用抗生素的種類不得超過(guò)1種,且產(chǎn)品的后續(xù)工藝應(yīng)保證可有效去除制品中的抗生素,去除工藝應(yīng)經(jīng)驗(yàn)證。病毒性疫苗生產(chǎn)中應(yīng)僅限于在細(xì)胞制備過(guò)程中使用抗生素。生產(chǎn)過(guò)程中使用抗生素時(shí),成品檢定中應(yīng)檢測(cè)抗生素殘留量,并規(guī)定殘留量限值。在新版藥典正文標(biāo)準(zhǔn)中除口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗糖丸外,所有病毒疫苗全部增訂抗生素殘留量檢測(cè),限值規(guī)定為:每1次人用劑量不高于50ng。3.3疫苗純化技術(shù)應(yīng)根據(jù)疫苗的使用規(guī)定進(jìn)行鑒于此,在疫苗研發(fā)過(guò)程中,應(yīng)首先嚴(yán)格控制原輔材料中可能帶有抗生素含量,這類原輔材料主要是生物類原輔材料,如牛血清、水解乳蛋白、胰酶等,同時(shí)應(yīng)考慮和研究使用生物原材料替代物進(jìn)行疫苗生產(chǎn);同時(shí)調(diào)整疫苗的生產(chǎn)工藝,通過(guò)降低甚至取消生產(chǎn)過(guò)程中抗生素加入和改進(jìn)疫苗的純化工藝,如增加細(xì)胞生長(zhǎng)液換洗次數(shù)、引進(jìn)純化技術(shù),盡可能降低抗生素的含量,最終使疫苗安全有效。疫苗中慶大霉素殘留量測(cè)定不易掌握,通過(guò)摸索學(xué)習(xí)總結(jié)了4點(diǎn)注意事項(xiàng):(1)室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(20～25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。(2)在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重