漆酶高產(chǎn)菌株的篩選實(shí)驗(yàn)方案

漆酶簡介漆酶是一種含銅的多酚氧化酶(Laccase,P-diphenoloxidase,EC.1.10.3.2)，廣泛分布于高等動植物、昆蟲、真菌分泌物和少量細(xì)菌中，其中最主要的是擔(dān)子菌亞門的白腐真菌。漆酶為含銅的糖蛋白，約由500個(gè)氨基酸組成，多為單一多肽，個(gè)別為四聚體。糖配基占整個(gè)分子的10%?45%，糖組成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差異，漆酶的分子量隨來源不同會有很大差異，甚至來源相同的漆酶分子量也會不同。通過對漆酶蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，漆酶具有3個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn),共結(jié)合4個(gè)銅離子，且這4個(gè)銅離子處于漆酶的活性部位，在催化氧化反應(yīng)中起決定作用，如果除去銅離子，漆酶將失去催化作用。漆酶具有較強(qiáng)的氧化還原能力，能催化多酚、多氨基苯等物質(zhì)的氧化，使分子氧直接還原成水，將酚類和芳胺類化合物還原成醌類物質(zhì)，沒有副產(chǎn)物的生成。由于漆酶具有特殊的催化性能和廣泛的作用底物，使得漆酶具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。漆酶應(yīng)用主要集中在制漿造紙，特別是紙漿的生物漂白，環(huán)境保護(hù)，木質(zhì)纖維素降解等方面。造紙工業(yè)方面，由于漆酶能高效的降解木質(zhì)素及與木質(zhì)素具有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，避免造紙工序中所使用的化學(xué)物質(zhì)影響環(huán)境。環(huán)境保護(hù)方面，漆酶能有效的除去工業(yè)廢水、化學(xué)農(nóng)藥當(dāng)中的毒物酚、芳胺、單寧和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在廢水處理等環(huán)保事業(yè)有廣闊的前景。分光光度法測定漆酶活力最常用的底物是2,2’-連氮一雙(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。實(shí)驗(yàn)一高產(chǎn)漆酶菌株酶活測定1主要試劑的配制（1） 0.2mmol/LpH4.5檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液A液：0.2mmol/L檸檬酸溶液：稱取檸檬酸21.014甘，加入蒸餾水溶解定容至500mL。B液：0.2mmol/L檸檬酸鈉溶液：稱取檸檬酸鈉29.412甘，加入蒸餾水溶解定容至500mL。A液和B液混合，攪勻，于pH計(jì)上調(diào)節(jié)至pH4.5。（2） 0.5mmol/L的ABTS溶液將一片ABTS片劑（142mg/片）用0.2mmol/LpH4.5檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液溶解定容至250mL,配成1.0308mmol/L的ABTS母液；再取48.5mL的ABTS母液，用0.2mmol/LpH4.5檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液定容至100mL。2實(shí)驗(yàn)方法漆酶活性的測定方法：從三角瓶中取出適量酶液，離心取上清得到粗酶液，放于樣品管中?？瞻坠芗尤?ml液體的PDA培養(yǎng)基。每支離心管中加入5倍的檸檬酸一檸檬酸鈉溶液稀釋。將樣品管，空白管，0.5mmol/LABTS放在恒溫水浴鍋中，30°C預(yù)熱10min。加入2mL預(yù)熱好的酶液和0.5mmol/LABTS溶液達(dá)到3mL的反應(yīng)液，于1cm比色皿中，啟動反應(yīng)5分鐘，測定420nm下吸光值隨時(shí)間的變化值，每分鐘讀一次數(shù)。在上述條件下，取吸光值變化的線性部分，定義每分鐘轉(zhuǎn)化1umol的底物所需的酶量為一個(gè)酶活力單位，用U/mL表示。運(yùn)用以下公式計(jì)算酶活。漆酶酶活力U/mL= A°D"1 x酶液稀釋倍數(shù)AtxV2xex10-6式中：e----ABTS在420nm下吸光系數(shù)，為3.6x104M-1?cm-1；At——1min；AOD----1min內(nèi)，吸光度OD的變化值；V1----酶反應(yīng)中，反應(yīng)液的總體積，3mL；V2----酶反應(yīng)中，酶液的體積，2mL。實(shí)驗(yàn)二高產(chǎn)漆酶菌株的酶學(xué)特性1主要試劑的配制（1） 0.2mmol/LpH2.0—8.0的檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液A液和B液混合，攪勻，于pH計(jì)上分別調(diào)節(jié)至pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。（2） 0.1—0.5mmol/L的ABTS溶液將一片ABTS片劑（142mg/片）用0.2mmol/LpH4.5檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液溶解定容至250mL，配成1.0308mmol/L的ABTS母液；再取48.5mL的ABTS母液，用0.2mmol/LpH4.5檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液分別配制100mL的0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的ABTS。2方法2.1米氏常數(shù)（Km值）的測定在pH3.5的條件下，配制0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L不同ABTS底物濃度，30°。反應(yīng)，測定漆酶反應(yīng)的初速度，求出二者的倒數(shù)，以1/V對1/[S]作圖，按照雙倒數(shù)法（Lineweave—Burk法）作圖，得到斜率為Km/V的直線，由此得到米氏常數(shù)Km值。2.2漆酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性測定將漆酶分別加入到pH2.0—pH8.0緩沖液中，在30°C下，測定漆酶活性，檢測漆酶的最適反應(yīng)pH。另外，將漆酶分別加入pH2.0—pH8.0緩沖液中，放置1h后，在30C，最適反應(yīng)pH條件下，測定漆酶活性，以開始時(shí)漆酶活力為對照，計(jì)算漆酶的相對活力，得出漆酶的pH穩(wěn)定性。2.3漆酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性測定在漆酶最適反應(yīng)pH條件下，分別在不同溫度（20C—80C）下，測定漆酶活性，得出漆酶的最適反應(yīng)溫度。將漆酶在pH3.5環(huán)境中，分別在不同溫度（20°C—80°C）下保溫1h，在最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH條件下測定漆酶活性，以保溫前漆酶活力為對照，計(jì)算漆酶的相對活力，得出漆酶的熱穩(wěn)定性。2.4表面活性劑對漆酶活性的影響將漆酶置于含有1mmol/L表面活性劑（Tris、EDTA、Tween80），pH8.0緩沖液中，測定漆酶活性，以不添加表面活性劑漆酶活力為對照，計(jì)算漆酶的相對活力，測定表面活性劑對漆酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)三漆酶的固定化一、 實(shí)驗(yàn)原理殼聚糖是一種生物相溶性好、可生物降解、無毒易得的天然功能高分子材料，被廣泛用來作為固定化酶的載體。殼聚糖分子中D一葡胺糖的-NH2可與雙功能試劑戊二醛的一個(gè)-CHO縮合，戊二醛的另一個(gè)-CHO與酶的游離氨基縮合，從而殼聚糖一戊二醛一酶結(jié)構(gòu)，即固定化酶。本實(shí)驗(yàn)采用以戊二醛為雙功能試劑的載體交聯(lián)法固定化漆酶。二、 材料、試劑和儀器材料：殼聚糖，漆酶試劑：1%的冰醋酸溶液、甲醛（37%）、1mol/LNaOH、0.8%的戊二醛（用磷酸緩沖液配制）、0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.2）、2mol/LNaOH1%冰醋酸溶液； 2mol/L的NaOH溶液37%的甲醛溶液； 0.1mol/LpH7.2的磷酸緩沖液；0.8%的戊二醛溶液； 0.1mol/LpH7.5的PBS磷酸緩沖液（內(nèi)含0.5mol/L的NaCL）0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH7.2）：NaHPO-12HO,25.79g；NaHPO.-12HO,七 七4.37g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。0.1mol/L的PBS磷酸緩沖液（pH7.5）：Na2HPO4*12H2O，30.08g；NaH2PO4?12H2O，4.37g，NaCL，29.22g用蒸餾水溶解并定容至1000ml。0.8%的戊二醛溶液：將25%的戊二醛用磷酸緩沖液配制而成，現(xiàn)配現(xiàn)用。三、 實(shí)驗(yàn)步驟殼聚糖凝膠顆粒的制備稱取0.5g殼聚糖充分溶解于35mL1%的冰醋酸溶液中，加入3mL甲醛(37%)迅速混勻，在40^水浴中靜置保溫60min，得到透明的凝膠，加少量蒸餾水將凝膠擠壓破碎，倒出并在研缽中進(jìn)一步破碎成適當(dāng)大小的凝膠顆粒，接著在燒杯中使其懸浮于100mL蒸餾水中，不斷地用2mol/L的NaOH將懸浮液的pH值調(diào)至8.0，放置10min，然后用蒸餾水在抽濾漏斗上洗滌凝膠顆粒數(shù)次，抽去多余水分，備用。殼聚糖凝膠顆粒的活化取上述凝膠顆粒10g，加入40mL0.8%的戊二醛，室溫放置60min，用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)洗滌凝膠顆粒3-4次，以除去多余的戊二醛，抽濾備用。酶的固定化向上述的凝膠顆粒中加入15mL漆酶酶液，4°C下放置1h，中間攪動數(shù)次，而后用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)洗滌凝膠顆粒3-4次，以除去未固定的酶，即得固定化酶。酶活力的測定溶液酶活力的測定殘留酶活力的測定固定化酶活力的測定四、數(shù)據(jù)處理及計(jì)算固定化酶總活力數(shù)活力回收(%)= X100%溶液酶總活力數(shù)固定化酶總活力數(shù)相對活力(%)= X100%溶液酶總活力數(shù)一殘留酶活力數(shù)實(shí)驗(yàn)四漆酶及固定化漆酶的應(yīng)用一、 漆酶對染料及果汁內(nèi)酚類物質(zhì)的降解漠甲酚綠二、 染料最大吸收波長的確定將漠甲酚綠用pH4.5的檸檬酸緩沖液溶解，于UV-2450紫外可見分光光度計(jì)在200nm-800nm范圍內(nèi)