納米生物醫(yī)學的研究與應用

納米生物醫(yī)學的研究與應用

0納米生物及其產物納米只是一個長度單位，相當于10億米。然而，當物質進入納米規(guī)模時，它們會發(fā)生顯著的性能變化并表現出獨特的功能。納米技術的潛在應用前景引起了人們的關注。納米醫(yī)學是納米技術的一個分支,指運用納米技術的理論與方法、在現代醫(yī)學和生物學的基礎上、開展生物醫(yī)學研究與臨床治療的新興邊緣交叉學科。納米技術在醫(yī)學中的應用主要有以下幾方面(圖1)。1)納米生物材料:具有自組裝的納米顆粒和其它類型的納米材料可提高機械性能和生物相容性。例如,利用納米材料制作牙和骨骼包裹物或替代物;制作帶有生物激活信號分子的埋植材料用于刺激生物體,如刺激細胞生長或分化。2)藥物載體:將納米粒子用于提高治療藥物的生物利用率和延遲藥物代謝活性。例如碳納米管、多聚物納米顆粒、納米枝狀體等。利用納米顆?；蛘呔哂歇毺匦阅艿募{米材料提高藥物分子的藥代動力學特征將會成為以納米醫(yī)學為基礎的新型藥物傳輸體系。3)醫(yī)學診斷:基于納米管、納米線或者原子力顯微鏡產生的新型的生物傳感器用于臨床醫(yī)學診斷,目的就是提高檢測靈敏度或者用于增強傳統(tǒng)方式無法診斷的病變。例如,超順磁性的氧化鐵顆粒作為MRI納米顆粒造影劑可提供良好的檢測信號對比度和生物分布度,有效提高診斷效率。4)納米治療:納米尺度的顆?；蚍肿涌梢灾苯佑糜谥委熂膊?由于它們自身的結構具備獨特的生物效果,從而區(qū)別于傳統(tǒng)的化療藥物。1納米纖維在細胞生物功能的應用納米無機生物材料是現在最廣泛運用于臨床的納米生物材料,包括納米陶瓷材料、碳納米管等,已經發(fā)展出一些有代表性的人工組織器官替代的納米材料(如人工骨、人工齒、人工角膜)[1~3]。與傳統(tǒng)材料相比,由于其粒徑的急劇減小,因而具有更大的比表面積和更多的表面原子。這些獨特的納米效應都使得納米材料較常規(guī)材料具有更高的生物活性。例如已廣泛用于人工骨研制的納米羥基磷灰石生物材料,它與骨骼主要成分的性能一致,生物相容性與細胞毒性遠小于傳統(tǒng)的合金材料,能夠很好地模擬骨骼結構,可以取代目前骨科醫(yī)療中的合金材料,在正畸醫(yī)療中具有顯著的優(yōu)勢。許多納米尺度的物質都存在著自組裝的性質,利用這一性質開發(fā)出了許多新型的納米生物材料。模仿天然的細胞外基質———膠原的結構,制成的含自組裝納米纖維的生物可降解材料已開始應用于組織工程的體外及動物實驗,并將具有良好的應用前景。目前自組裝支架的缺點之一是不能控制其形成大的孔徑,容易被降解,不能形成穩(wěn)定的三維結構。然而,自組裝納米材料大多是水凝膠類物質,所以很方便注射且生物相容性好,利于體內修復組織,因而成為近年來科學家關注的焦點。Beniash等結合多價態(tài)金屬離子與一些自組裝的水凝膠用作細胞吸附介質。實驗結果表明,此材料可使MC3T3成骨細胞在上面存活3周。Jeffrey等發(fā)現了一種納米自組裝納米短肽,可以用于臨床上的快速止血,這種短肽由16個氨基酸構成,在自組裝過程中折疊成β結構。這種新型的納米止血機器將會給未來的外科手術帶來革命性的變革。自組裝三維培養(yǎng)水凝膠或者微孔刷結構PEG水凝膠等可以用于更好地模擬各種體內環(huán)境,使我們能更加準確地在體外研究各種細胞,特別是腫瘤細胞的各種特性,從而更好地指導臨床藥物治療和新藥物的開發(fā)。最近,更有意思的發(fā)現是單純的納米顆粒具備酶的活性,在一些應用中可代替天然存在的酶并具有酶的功能。Gao等發(fā)現了磁性納米顆粒Fe3O4具備和天然過氧化物酶,如辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)類似的特性,并具有比天然酶更穩(wěn)定、易生產的優(yōu)勢?；诖?他們發(fā)明了一種新的免疫測定方法,利用葡聚糖(Dextran)修飾Fe3O4后使其具有很好的生物相容性,外接蛋白A代替與酶共軛連接的二抗,應用于ELISA測定乙型肝炎表面抗原。在H2O2存在時,此修飾后的納米顆粒發(fā)生顏色反應。這是首次發(fā)現無機材料具備天然生物蛋白的功能。接著,wei等利用Fe3O4納米顆粒所具備的氧化還原特性來檢測H2O2和葡萄糖,結果表明,對H2O2的檢測精度可達到3×10-6mol/L,對葡萄糖的檢測精度達到5×10-5~1×10-3mol/L,且具備特異性。無機納米材料合成容易并且穩(wěn)定,應用于生物體系無疑是令人振奮的。若將此技術與細胞內線粒體呼吸鏈體系聯系起來,利用無機納米粒子代替生物體內的氧化還原酶功能將會對細胞凋亡、癌癥研究提供一個新的研究體系。另外,利用抗體修飾的磁性納米顆?？删邆洳东@、分離和探測功能。相關更深入的研究有待進一步發(fā)現。2靶向和自組裝治療傳統(tǒng)的給藥方式不能達到微量、高效、穩(wěn)定、靶向等目標,利用納米顆粒作為藥物和基因輸送載體,可延長藥物作用時間;可達到靶向輸送目的;可增強藥物效應,減輕毒副反應;可提高藥物的穩(wěn)定性;可保護核酸類藥物,防止其被核酸酶降解;可幫助核苷酸分子高效轉染細胞,并起到靶向定位作用;可建立一些新的給藥途徑。因此,利用納米技術運載藥物及生物活性分子(肽、蛋白和DNA等)是目前研究的熱點。通過對納米顆粒修飾小肽、葉酸或轉鐵蛋白等分子提高藥物輸送的靶向性,從而避免了藥物在其它非特異性組織的釋放。腫瘤組織自身具有特殊的性質,如代謝速度快、消耗養(yǎng)分多等,利用其有別于正常組織的特點,通過在納米載體如單壁碳納米管上包裹PEG并連接一種活性短肽RGD,可以建立一種安全、高效的藥物傳遞方法和顯影方法,用于諸如癌癥等疾病的治療。Villa等利用靶向序列RGD修飾、連有放射性同位素標記、利用寡核苷酸進行自組裝,構建了一種多功能單壁碳納米管(simple-walledcarbonnanotubes,SWNTs),能夠特異性識別互補序列并可在體內進行自組裝。在荷瘤鼠體內驗證其具有靶向和自組裝能力。這種新奇的治療策略可實現對腫瘤的靶向藥物治療或通過交聯作用干擾腫瘤新生血管的生成。Li等利用PEG修飾包有抗癌藥物多柔比星(doxorubicin)的脂質體后再連接轉鐵蛋白,對接種人肝癌細胞(HepG2)的小鼠進行治療,研究發(fā)現荷瘤鼠腫瘤部位藥物聚集量明顯增加,并且顯著降低了藥物在心臟和腎臟的聚集,降低了抗癌藥物的副作用。枝狀聚合物具有很好的生物相容性和較強的捕獲能力,一直作為較為理想的納米顆粒修飾物。Pan等利用聚乙二胺枝狀物修飾多壁碳納米管(polyamidoaminedendrimermodifiedmulti-walledcarbonnanotubes,dMNTs),以此攜帶FITC標記的c-myc反義引物與人乳腺癌細胞(MCF-7)共培養(yǎng),15min內就進入細胞并且限制腫瘤細胞的生長,顯著降低了c-myc基因的表達。說明,dMNTs可作為一種理想的藥物和基因載體用于腫瘤的治療。Tang等通過自組裝程序形成一種聚乙二醇-腦磷脂共聚物(polyethyleneglycolphosphatidylethanolamine,PEG-PE),攜帶抗癌藥物多柔比星,可增加人非小細胞肺癌(A549)細胞的內吞作用和多柔比星的細胞毒性。體外試驗證實,其能有效地限制腫瘤生長,提高抗癌藥物的抑瘤率,并且可延長荷瘤鼠的生存期,限制肺癌轉移,且對身體的毒副作用小。這為臨床的癌癥治療提供了一種有效的方法。另外,磁性納米顆粒也是靶向性藥物載體中的研究熱點,Amirfazli等研制的納米磁性氣溶膠顆?？梢栽谕獯艌龅囊龑戮_地到達肺癌的病變部位,達到精確的藥物傳遞。納米藥物不但可以通過納米顆粒裝載藥物或者與藥物結合的方式突破細胞屏障,還可以通過不直接與藥物反應而是協(xié)助的方式突破細胞屏障,甚至可以突破完整的表皮等皮膚組織傳送大的親水類藥物。比如納米短肽ACSSSPSKHCG就可以幫助胰島素成功地穿過腹部皮膚到達人體血管組織,這一發(fā)現對無創(chuàng)傷給藥技術提供了新的思路。此外,納米智能藥物載體的制備是納米生物技術的另一個分支。智能納米藥物就是采用納米技術制備納米藥物顆粒,結合靶向給藥和智能釋藥優(yōu)點,用納米技術制備的智能納米緩釋藥物體系,除了既能定點給藥之外,還能根據用藥環(huán)境的變化(如溫度、pH變化等),調整在不同環(huán)境下的釋藥方式。這些技術的發(fā)展無疑會對給藥的精確性、易操作性提供幫助。3高效治療的度疾病診斷是臨床醫(yī)學中非常重要的一部分,準確、高精度的診斷是高效治療的重要前提。在最近的幾年中,納米技術的研究推動了疾病診斷技術的快速發(fā)展,主要體現在造影成像技術、新型診斷方法和快速診斷等方面。3.1納米生物學土藥在超聲應用方面,隨著超聲分子成像技術和生物納米技術的迅猛發(fā)展,近年來出現了多種納米級超聲造影劑。納米級造影劑通過在制備過程中調整納米顆粒理化特性,使造影劑粒徑小于700nm,以穿越血管內皮進入組織間隙,使血管外靶向組織顯像成為可能,從而超越了常規(guī)造影劑僅能產生血管內顯像的局限性,推動了超聲分子顯像與納米靶向治療向血管外領域的拓展。比如Oeffinger等采用司盤60和吐溫80包裹全氟丙烷氣體制備了平均粒徑介于380~780nm之間的納米級微泡,不但能透過血管,而且能得到相對較強的背向散射回聲。除此之外還得到了納米級脂質體造影劑、納米級氟烷乳劑等多種新型納米級超聲造影劑。在MRI應用方面,生物修飾化的納米氧化鐵是一種水溶性膠質,作為造影劑注射到血液后在正常肝臟和脾臟內會被網狀內皮細胞吸收。當這些臟器癌變時,由于所含網狀內皮細胞大量減少,只能吸收少量氧化鐵,從而在核磁共振的影像上顯示出差別,由此能夠很好地區(qū)分正常組織和惡性腫瘤組織。對于早期診斷來說,診斷靈敏度是其中至關重要的因素,Takeshita等運用超順磁性氧化鐵納米脂質體顆粒對肝癌進行了研究,證實可準確檢測到直徑3mm以下的體內腫瘤。3.2qds和熒光熒光分析法是生物學研究中十分重要的方法之一,其檢測靈敏度很大程度上取決于標記物的發(fā)光強度和光化學穩(wěn)定性。目前使用的有機熒光染料由于不可克服的熒光性能缺陷,極大地限制了其在生命科學中的應用。1998年,Alivisatos等和Nie的兩個研究小組首次將量子點(quantumdots,QDs)這一納米材料引入生物學領域,此后其在生物及醫(yī)學領域中的應用研究受到了極大的關注,在應用與研究方面取得了巨大的進步。量子點又稱為半導體納米晶體,是一種由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米顆粒,直徑約l~100nm,其在激發(fā)光的誘導下會產生熒光[21~23]。與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比,量子點具有很好的光穩(wěn)定性和很寬的吸收波譜,因此可以用一種單一波長的激發(fā)光源來同時激發(fā)多種QDs,其發(fā)射波譜可以根據量子點的大小及組成材料進行調節(jié),因此可以同時使用多種顏色的探針而不會發(fā)生影響實驗結果的波譜重疊現象?；谶@些優(yōu)越的光學性質,量子點已逐步應用于蛋白質和DNA的檢測、細胞的一元和多元標記成像、活細胞生命動態(tài)過程示蹤及活體動物體內的腫瘤細胞靶向示蹤等許多生物醫(yī)學領域,并取得一系列突破性研究進展[24~26]。Akiyoshi利用脂質體包裹量子點用于細胞內標記和成像研究,利用它可以很直觀地看到各種化療藥物在細胞內的狀態(tài),利于研究其藥理作用。利用量子點的尺寸效應和優(yōu)良的光學特性,研究人員通過對其修飾使其能產生近紅外的熒光用于淋巴結造影。另外,修飾后的量子點還可用于RNA的載體應用于轉基因研究。Yezhelyev等利用量子點作為siRNA(shortinterferingRNA,siRNA)的載體,將量子點用叔胺和羧酸修飾后連接siRNA,將基因沉默效率提高了10~20倍,并減少細胞毒性5~6倍,還可以做到實時監(jiān)測siRNA在細胞中的位置和釋放情況。Walther等利用人類降鈣素hCT(18-32)-K7(humanhormonecalcitonin,hCT)修飾的量子點研究其細胞毒性及細胞的內吞機制,發(fā)現此體系能有效地攜帶RNA進入細胞。這些新的發(fā)現解決了RNA轉染效率的問題并實現了實時監(jiān)測,這為納米成像和臨床治療提供了一種新的方法和策略。3.3納米表征檢測技術在病原體的快速檢測方面,膠體金、納米金等納米顆粒顯示出了巨大的潛力。利用金納米顆粒結合雜交DNA片段,能夠很容易地穿透細胞膜進入細胞核與核內染色體結合,并具有較高的特異性,可以克服目前基因診斷所面臨的熒光染料的低穩(wěn)定性、分子雜交過程中對反應環(huán)境的高依賴性,以及所需設備昂貴等困難,進一步有效提高基因診斷在臨床中的應用價值。此外,在納米金上連接與病原體特異性結合的基團,如炭疽桿菌的特異核酸片段,當與病原體結合后,納米金聚集在一起,從而發(fā)生顏色反應,可以快速直觀地得到病原體檢測結果。運用納米表征手段還能得到一些新的檢測思路。目前腫瘤診斷是建立在組織、細胞水平上的病理學方法,存在著良、惡性及細胞來源判斷不準確的問題。原子力顯微鏡可以檢測腫瘤細胞的納米級結構異常改變,在分子水平揭示腫瘤的形態(tài)特點,做出更準確的診斷。比如通過原子力顯微鏡等納米技術發(fā)現癌細胞在彈性上比健康細胞更軟,可以根據這一原理通過納米技術檢測細胞膜的彈性從而達到臨床上腫瘤組織確診的目的。利用激光單原子檢測技術,我們可以快速地監(jiān)測到環(huán)境或樣本中的病原體與危險物質,保障公共衛(wèi)生與安全。通過植入納米級的傳感器,未來醫(yī)生可以獲得病人任意時刻的生理信息,保證正確治療與急救。一些納米顆粒,例如碳納米管,可以同時連接多個基團:靶向基團、示蹤顯影基團、藥物治療基團等。用這些納米顆粒就可以形成多種具有高靈敏性、高特異性的納米藥物,納米顯影劑和示蹤劑。通過將具有光學性質的量子點和用于藥物裝載的納米材料,如碳納米管,連接起來還可以進行納米藥物體內運輸傳遞方面的研究。4提高藥代動力學現在市場上的納米藥物主要是一些起到藥物傳遞作用的靶向性藥物(占到納米藥物市場的70%以上),一般是用有靶向功能的納米顆粒裝載或者連接傳統(tǒng)藥物,達到提高藥效、降低毒性的目的。這類藥物尤以有毒的抗腫瘤化療藥物居多,普通化療藥物進入人體后,首先沿血液循環(huán)在人體內均勻分布,每克腫瘤組織的絕對劑量僅為注射劑量的0.0007%~0.01%,臨床療效很低。將化療藥物制成納米顆粒,通過藥物控制釋放體系直接靶向作用于病變組織,可大大提高療效并降低化療藥物的毒副反應。除開載體類藥物外,也發(fā)展出了許多利用納米顆粒本身的性質或直接利用納米技術進行治療的手段,而這類治療方法在未來將發(fā)揮更顯著的作用。4.1納米顆粒及納米自身在腫瘤預防中,將藥物本身制成納米顆粒有很多好處。例如補硒能夠有效地降低多種人類癌癥的發(fā)生,但硒化合物的毒性作用使其應用受到限制。有研究者用半合成法將硒化合物制成納米微粒,具有低毒高效的特性。通過將一些傳統(tǒng)藥物加以改造制成納米顆?？梢赃_到優(yōu)化藥物特性的目的。比如將核苷類抗癌、抗腫瘤藥物連接到角鯊烯上,可以聚集成100~300nm的納米顆粒,這將提高藥物的藥效和穩(wěn)定性,降低腫瘤的抗藥性。納米藥物顆粒治療不但可以通過納米技術降低藥物毒性,提高藥物的藥效和穩(wěn)定性,有的物質納米化后將出現新的治療作用。比如二氧化鈰納米顆?？梢郧宄壑械碾娍剐苑肿硬⒎乐我恍┯捎谝暰W膜老化而帶來的疾病。一些納米自組裝材料,如納米短肽,可以用于臨床上的快速止血,甚至還可以運用于對受損視覺神經的修復等。單獨應用納米顆粒進行腫瘤的治療是一種新穎的治療方案,Chen等利用Gd@C82(OH)n處理荷肝癌的小鼠時發(fā)現,在10-7mol/kg的注射劑量下能有效地抑制腫瘤并對機體不產生任何毒性,明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的化療藥物。其抑瘤效應并不是通過納米顆粒對腫瘤的直接殺傷起作用,而是通過另外的機制來完成,諸如免疫機制。近期的研究發(fā)現,在應用此納米顆粒治療荷瘤鼠時,通過監(jiān)測小鼠血清中的細胞因子發(fā)現在用納米顆粒治療腫瘤后,增加了T細胞亞型Th1型因子IL-2、IFN-γ、TNF-α的分泌,說明它有可能是通過激活機體免疫來實現對腫瘤的抑制作用。另外,我們研究組的結果也顯示存在此免疫激活機制,同時還存在抑制腫瘤血管的效應。腫瘤部位存在免疫細胞缺陷,其血管具有高滲透性,使得一定尺寸、大小和分子量的顆粒物具有非特異靶向性,這種非特異性的腫瘤富集現象稱為EPR效應(enhancedpermeablityretentioneffect,EPR),Gd@C82(OH)n納米顆粒在生理狀態(tài)下以聚集狀態(tài)存在,也許通過EPR效應作用于腫瘤血管(未發(fā)表)。發(fā)現新的無毒高效的納米顆粒用于腫瘤治療給我們提示了一種新的思路,具有重要的臨床意義。4.2納米級的醫(yī)療器械在新的藥物和治療方法開發(fā)時,碳納米管與抗原性短肽的共軛產物可以被用于制備新型高效的合成疫苗應用系統(tǒng)。在開發(fā)人工器官時,在其表面涂上生物相容物質的納米粒子,可預防人工器官移植的排異反應。研究者甚至可以開發(fā)制造納米級的醫(yī)療器械用于醫(yī)學細胞操作或者生物治療。加州大學伯克利分校的CarolynBertozzi小組就曾用碳納米管制造了只有10~20nm寬的針,通過這種針可以在不對細胞膜造成任何損傷的情況下將材料注射進細胞。利用納米顆粒的磁熱或者光熱效應還開發(fā)出了一系列新的治療方法,特別是順磁性或超順磁性的鐵氧體納米顆粒,在外加磁場的作用下,溫度升高至40~45℃時,可達到殺死腫瘤的目的。4.3plga納米顆粒免疫一些納米顆粒通過包裹或者與疫苗相互偶聯,能夠使例如蛋白抗原等疫苗的表面充分暴露,同時能使抗原結構更趨穩(wěn)定,在生物體內能輔助實現持久地釋放被包裹的抗原,或加強吸收作用和機體免疫系