淺談使用克倫特羅試劑盒檢測飼料中克倫特羅的含量

淺談使用克倫特羅試劑盒檢測飼料中克倫特羅的含量

克倫特羅是一種鎮(zhèn)痛藥。近年來，非法添加到飼料中用于提高脂肪性動物的瘦肉率，加速動物的生長。由于其添加量是治療劑量的5.10倍，動物體內(nèi)殘留量很大，這將給消費者帶來損害。目前克倫特羅檢測方法有液相色譜法(LC),氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS),液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)等。但這些檢測方法操作復(fù)雜、成本較高,而篩選法是實施檢測的第一步,用于大量樣品的高通量分析,目的是檢測某種或某類危害物是否存在,它簡單快速。篩選法基于許多原理,但目前應(yīng)用最多的是酶聯(lián)免疫吸附法(簡稱ELISA法),該檢測方法敏感性高、特異性強、重復(fù)性好,具有操作簡便、分析速度快、靈敏度高、樣品容量大、樣品前處理簡單、儀器化成本低和分析成本低等優(yōu)點,是目前最理想的殘留篩選性分析方法之一。由于“瘦肉精”中毒事件和出口水產(chǎn)品氯霉素風(fēng)波,使得ELISA法在我國畜產(chǎn)品安全檢測中得到了廣泛應(yīng)用。1克倫特羅的含量試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在酶標(biāo)板的微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,當(dāng)樣品加入到各個微孔中后,樣品中殘留的克倫特羅和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗克倫特羅抗體,加入酶標(biāo)二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其殘留物克倫特羅的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中克倫特羅的含量。2不含污染物飼料的粉碎飼料樣品抽取后,應(yīng)嚴(yán)格按照飼料樣品分裝和粉碎的規(guī)定進行分裝、粉碎,避免不同飼料樣品相互污染。將樣品袋中的飼料樣品充分搖勻后,用潔凈的樣品稱量勺進行取樣,要注意的是,每取完一個樣品時都必須要將稱量勺擦干凈。3交叉反應(yīng)率測定目前酶聯(lián)免疫法檢測用試劑盒種類繁多,如何選擇既能滿足檢測要求又價格低廉的試劑盒是一個問題。本人根據(jù)使用這些試劑盒,在實際檢測中發(fā)現(xiàn),一般在試劑盒說明書中列出以下指標(biāo):最低檢測限;回收率;交叉反應(yīng)率;標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜及數(shù)據(jù),標(biāo)準(zhǔn)曲線至少由5個濃度組成;IC50測定值及變形曲線點數(shù)目,是比較規(guī)范的試劑盒,可以選擇。4溫度穩(wěn)定試劑盒通常是在2～8℃的條件下保存,不能冷凍,使用前將試劑盒從冰箱中取出于室溫條件下回溫,待回溫至室溫后方可使用,試劑盒在室溫條件下放置時間最好不要超過24h,所以應(yīng)將沒有使用完的試劑盒及時地放回冰箱中保存,將不用的酶標(biāo)板微孔條放進自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。另外,一般試劑盒的有效期為12個月,不要使用過了有效日期的試劑盒,也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過了有效期的試劑盒會導(dǎo)致靈敏度的降低,同樣地,不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。5應(yīng)在測試試劑盒時考慮以避免的問題5.1回溫和回溫時回溫5.1.1室溫及試劑盒的溫度條件。室溫最好在25℃左右,試劑盒應(yīng)提前從冰箱中取出于室溫條件下回溫,待回溫至室溫后方可使用。若室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫(20～25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的吸光值(OD值)偏低。5.1.2恒溫箱的溫度條件。操作前應(yīng)先打開恒溫箱,并設(shè)置好所需溫度,待避光孵育前檢查恒溫箱的溫度是否達(dá)到所需溫度。5.2吸頭操作時吸頭注意事項先加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本置相對應(yīng)的微孔中,注意每加一個標(biāo)準(zhǔn)品或樣本必須更換吸頭;再加入后面的各試劑時,吸頭不能靠在板孔壁上,要懸空加入,以防止交叉污染;吸取各試劑或樣本時,要防止少加、漏加的現(xiàn)象而影響測定結(jié)果。5.3液壓吸頭的加入無洗板機時建議使用多孔加樣器,觀察吸頭是否安裝牢固,以確保每孔加入的洗滌工作液相同;同樣地,加洗滌液時吸頭不能靠在板孔壁上,要懸空加入,以防止交叉污染;不要漏洗板孔。整個操作過程不要讓板孔干燥,洗板后應(yīng)立即進行下一步操作,不要中斷實驗去從事其他事情,因為在洗板過程中如果板孔干燥則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性、重復(fù)性不好的現(xiàn)象,所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。此步的操作關(guān)系到測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。5.4.注意克倫特羅的檢測在顯色反應(yīng)過程中,由于板孔中含有兩種或兩種以上試劑,所以加樣完成后需在桌上做圓周運動以混勻,混勻時要注意防止孔內(nèi)的液體濺出。在加入底物液A和底物液B后,顯色了規(guī)定的時間后,若顏色較淺,可以適當(dāng)?shù)匮娱L顯色反應(yīng)時間,但延長時間不得過長,一般不超過10min。畜產(chǎn)品的質(zhì)量安全與我們?nèi)祟惖慕】迪⑾⑾嚓P(guān),國家食品安全監(jiān)督管理部門、國家農(nóng)業(yè)部以及飼料辦等部門都相繼頒布了相關(guān)的法律法規(guī)和相關(guān)的檢測方法,使得動物用飼料中的克倫特羅含量得到了有效的控制。本文就使用試劑盒通過酶聯(lián)免疫吸附試